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生物样本透射电镜测试的各类样品制备方法
来源: 时间:2024-11-05 10:52:15 浏览:2364次

生物样本透射电镜测试的各类样品制备方法

 

生物样本透射电镜(Transmission Electron Microscopy,简称TEM是一种利用电子束穿透样品进行成像和分析的显微技术,具有极高的分辨率,能够观察到细胞结构、病毒、蛋白质等生物样品的纳米级细节为了获得高质量的TEM图像,样品的制备至关重要。

一、概述

透射电镜样品制备的基本目标是保持生物样品的自然状态,同时提高样品的电子透明度,以便电子束能够穿透并产生清晰的图像;制备过程通常包括固定、脱水、渗透、包埋、切片、染色和安装等步骤。

二、样品制备方法

(一)固定

固定是样品制备的第一步,目的是迅速杀死细胞,并尽可能保持其生前状态;常用的固定剂有戊二醛和锇酸,戊二醛能快速穿透细胞,固定细胞质和细胞膜,而锇酸则固定细胞核和细胞器。

1. 戊二醛固定:将样品置于2.5%的戊二醛溶液中,4℃下固定数小时至过夜。

2. 锇酸固定:戊二醛固定后,用锇酸进行后固定,通常在4℃下进行1-2小时。

(二)脱水

脱水是为了去除细胞中的水分,以便后续的渗透和包埋。常用的脱水剂有乙醇和丙酮,浓度从30%逐渐增加到100%

(三)渗透

渗透是将脱水剂替换为能与包埋剂相容的溶剂,如环氧树脂,使包埋剂能够渗透到细胞内部。

(四)包埋

包埋是将样品嵌入到固体介质中,以便进行切片。常用的包埋剂有环氧树脂、聚酯树脂等。

(五)切片

切片是将包埋好的样品切割成超薄(通常50-100纳米)的切片,以供TEM观察。切片方法有超薄切片和冷冻切片等。

1. 超薄切片:使用超薄切片机,如莱卡UC6或钻石刀,获得超薄切片。

2. 冷冻切片:在冷冻状态下,使用冷冻切片机切割样品。

(六)染色

染色是为了增强样品的对比度,使其在TEM下更容易观察。常用的染色剂有醋酸铀、柠檬酸铅等。

(七)安装

将染色后的切片安装在TEM专用的铜网或微栅上,准备进行TEM观察。

三、特殊样品制备方法

1. 细胞内特定结构的标记:对于需要观察细胞内特定结构的情况,可以使用免疫金标记、免疫电子显微镜技术等对目标结构进行标记。

2. 原位杂交:原位杂交技术可用于检测细胞内特定的RNADNA序列,结合TEM技术,可以观察到特定序列在细胞内的分布。

3. 冷冻断裂技术:冷冻断裂技术适用于研究细胞膜的内部结构。样品在冷冻状态下断裂,暴露出细胞膜的内部结构,然后进行TEM观察。

四、注意事项

1. 在整个制备过程中,要尽量减少对样品的损伤,保持其原始结构。

2. 确保固定、脱水、渗透、包埋等步骤的试剂和设备清洁,避免污染。

3. 切片时要保证切片的厚度均匀,以便获得高质量的TEM图像。

4. 染色过程中要控制染色时间,避免过度染色。

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全部 3小时前 四川
文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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