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实时荧光定量PCR

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项目介绍

检测各类样品,如动植物组织、细胞液、全血等样品中目标基因的存在以及相对含量。

实验流程:取材-RNA提取-测浓度-逆转录成cDNA-qPCR检测-数据分析-发报告

项目案例

样品要求

1. 请提供已知的全长基因序列和详细背景资料:DNA/RNA来源,丰度;

2. 请您提供新鲜的且尽量多的材料,或直接提供纯化好的总RNA或DNA(大于5ug/样本)。

3. 动物组织:样本离体应当立即放入液氮或-80℃冰箱中速冻保存,避免反复冻融,并且样本在-80℃的保存时间不宜过长,若保存时间超过半年应及时与工作人员取得联系,组织寄送100mg以上,脂肪组织,结缔组织,纤维化组织适当增加,干冰运输;

4.植物:新鲜的叶、果肉、种子等最少需100mg,干冰运输。

5.细胞:1×10^6个细胞,加入trizol的细胞样本(不要直接运输加trizol的细胞培养皿),Trizol 为裂解液,不适用于组织样本的保存,细胞除外,干冰运输;

6.全血:最少1 mL新鲜血液EDTA抗凝管,4度运输; 血清:最少1 mL,干冰运输;

7.RNA样品: OD260/280为1.8-2.0,浓度≥100 ng/μL,体积≥20μL,干冰运输;cDNA:cDNA原液≥20 μL,干冰运输;

8. 对于完成实验后,剩余样本需要返还的项目,需在收到项目完整版结题报告一个月内告知公司,逾期样本将安排清理。如果样本特别珍贵,需提前说明。一般情况下,样本不予返还;样本返回需要客户承担返还费用(包括干冰费和快递费)。


注意事项:在装样品的EP管上面做好标记,并且样本命名应与《项目送样单》保持一致,并在送样时用密封袋装好;因样本试提取或检测均会消耗部分样本,所以送样样本量需至少高于上述提及样本量的三分之一,建议所有样本均做好备份;

常见问题

Q1、1.无Ct值出现

检测荧光信号的步骤有误:一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

1、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。

2、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

3、模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Q2、2.Ct值出现过晚(Ct>38)

1、扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。

2、PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

3、PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。

Q3、3.溶解曲线不止一个主峰

1、引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

2、引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。

3、镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。

4、模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

Q4、4.扩增效率低

1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

2、反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

3、反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

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