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    实时荧光定量PCR(qPCR)的实验步骤解析
    来源: 时间:2022-12-29 09:33:40 浏览:2946次

    qPCR: Quantitative Real-time PCR,中文名是实时荧光定量PCRqPCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

    TakaRa 试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time),SYBRGreenⅠ法。

    实验步骤:

    一,去除基因组DNA反应:

    全波长酶标仪测出RNA浓度(单位ng/ul);按照以下剂量配制10ul体系

    试剂使用量
    5×gDNA Eraser Buffer2 μl
    Buffer 2.0 μl gDNA Eraser1 ul
    Total RNA1ug/RNA浓度
    RNase Free dH2OUp to10 ul

    PCR程序:42℃ 2min

    4℃ ∞

    二,反转录反应:

    按照以下剂量配制20ul体系:

    试剂使用量
    步骤 1 的反应液10 ul
    PrimeScript RT Enzyme Mix I1 ul
    RT Primer Mi1 ul
    5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 ul
    RNase Free dH2O4 ul
    Total20 ul

    PCR程序:37℃ 15min

    85℃ 5s

    4℃ ∞

    三,Real Time PCR

    按照以下剂量配制20ul体系:

    试剂使用量
    SYBR@ Premix Ex TaqII(2X)10 ul
    F Primer(10uM)0.8 ul
    R Primer(10uM)0.8 ul
    ROX Reference II0.4 ul
    反应2的DNA模板2 ul
    ddH2O6 ul

    四,仪器设置

    仪器使用的是荧光定量PCR仪Q6-96,设置界面如下图:

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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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