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蛋白质免疫印迹实验(WB)

蛋白质免疫印迹实验(WB)

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项目介绍

蛋白质免疫印迹法,即Western Blot,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

项目案例

样品要求

1.WB检测组织量要求为100mg(即黄豆大小);

2.细胞量要求为10^6及以上,细胞收集方式—— 贴壁细胞:倒掉培养基,pbs清洗2-3次,用细胞刮收集细胞,2000g,离心5min,然后去掉上清液,细胞沉淀干冰运输; 悬浮细胞:2000g,离心5min,然后收集细胞沉淀,干冰运输;

3.血液样本:全血采用EDTA-抗凝管装,至少1ml,4度运输,血清或白细胞采用干冰运输;

4.剩余样本需要返还的项目,需要提前备注。在收到项目完整版结题报告一个月内告知公司,逾期样本将安排清理。如果样本特别珍贵,需提前说明。一般情况下,样本不予返还;样本返回需要送样方承担返还费用(主要是干冰费和快递费)。

常见问题

Q1、1、为什么蛋白质印迹条带大小与预期的不同?

答:蛋白质印迹是一种基于蛋白质大小来分离蛋白质的技术。一般来讲,蛋白质越小,在胶上的迁移速度越快。但迁移速度也受其它因素的影响,因此,观察到的实际条带大小可能与预测的不同。

常见的因素包括:

1.翻译后修饰:例如磷酸化、糖基化等,可增加蛋白质大小。

2.翻译后切割:例如许多蛋白先被合成为前蛋白,然后被切割产生活性形式,例如前半胱天冬酶。

3.剪接变体和异形体:可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。

4.相对电荷-氨基酸(带电和不带电)多聚体组分,例如蛋白质的二聚化。这种情况通常在还原条件下需要防止,但强相互作用会导致较大的条带出现。

Q2、2、蛋白样本为什么要进行还原和变性?

答:为了使样本被还原和变性,样品缓冲液中会含有十二烷基硫酸钠(SDS)和β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。SDS是一种变性剂,用来打破蛋白的高级结构,变成初级的氨基酸结构,同时以恒定的质量比包被蛋白质,使其带上负电荷。这一恒定的负电荷比是下一步凝胶电泳分离的关键。β-巯基乙醇和DTT都是还原剂,用来断开蛋白自身的二硫键,进一步使蛋白质变成线性结构,此图中简单地展示了这一过程。顺便提一下,有些抗体只能够识别目标蛋白的天然结构,在这种情况下,样本不需要被还原和变性。所以还原和变性的步骤可以省略。但是,大多数蛋白质印迹分析都需要在还原和变性的体系中进行。

Q3、3、为什么检测重组蛋白时难以获得条带?

答:抗体检测重组蛋白质时,存在难以克服的困难,有必要加以考虑。所以推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。同时,如果重组蛋白带有标签,标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的C或N末端,以降低这种情况发生的可能性(而不是位于蛋白质的阅读框中间)。

Q4、4、牛奶和 BSA 封闭有区别?

答:抗体可能对封闭剂敏感,一般来讲,BSA会产生更清晰的结果,因为BSA含有较少的蛋白,因而抗体较少与其发生交叉反应。但并非总是如此,有些抗体在牛奶中的效果更好,因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白,能封闭更多不同类型的蛋白质。

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