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    蛋白免疫印迹实验的步骤讲解及结果分析
    来源: 时间:2023-09-15 16:30:23 浏览:3934次

    蛋白免疫印迹实验步骤讲解及结果分析


    蛋白免疫印迹(Western blot)是一种常用的蛋白质检测技术,能够确定目标蛋白的存在、浓度和鉴定其分子量等特征。本文将详细介绍蛋白免疫印迹实验的步骤,并提供结果分析的指导。

     

     

     

    实验步骤:

    一.样品制备:

    蛋白免疫印迹实验的第一步是样品制备。通常,您可以从细胞培养物、动物组织或微生物培养物等样品中收集蛋白质。在此过程中,您需要避免蛋白质的降解和失活。

    以下是一般的样品制备步骤:

    a. 收集细胞或组织:使用适当的缓冲液洗涤细胞或组织,以去除杂质和外部污染物。

    b. 细胞破碎:加入蛋白提取缓冲液(含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂),破坏细胞膜和核膜,释放蛋白质。

    c. 离心:将细胞裂解液或组织裂解液进行离心,去除细胞碎片和核酸等杂质。

    d. 收集上清液:将上清液转移到新的离心管中,以去除未溶解的固体。

     

    二.蛋白质浓度测定:

    在进行免疫印迹实验前,您需要确定蛋白质的浓度,以便加载相同的蛋白质量进行电泳分离。有几种方法可用于测定蛋白质浓度,如BCA法或Bradford法。

    a. BCA法(双硫键还原法):首先,准备一系列蛋白质标准溶液,使用乙醇胺胸腺嘧啶(BCA)试剂与蛋白质反应,生成可测定光密度的复合物。

    b. Bradford法:该方法使用考马斯亮蓝G-250试剂,该试剂与蛋白质结合形成深蓝色物质,测量其吸光度。

     

    三.SDS-PAGE电泳:

    SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)是一种将蛋白质按照分子量大小进行分离的常见方法。以下是简要的步骤:

    a. 准备凝胶:根据实验需要选择合适的聚丙烯酰胺凝胶浓度和孔隙度。通常使用10%至15%的凝胶。

    b. 配制电泳缓冲液:根据实验室的标准操作程序制备Tris-缓冲溶液,加入适量的SDS和硫酸铵,调整pH值。将电泳缓冲液加入电泳槽中。

    c. 加载样品:将样品蛋白质与加载缓冲液混合,加热至95°C,使之变性。然后,将样品加载到凝胶孔中。

    d. 电泳:将凝胶浸入电泳槽中,将电泳槽两端连接到电源,施加适当的电压使蛋白质沿凝胶电泳。

    e. 停止电泳:当蛋白质移动到合适位置或接近凝胶底部时,停止电泳。

    f. 凝胶染色:使用染色剂(如Coomassie蓝染液)对凝胶进行染色,以显示蛋白质带状。

    g. 存储凝胶:将凝胶转移到显影仪或图像记录系统中,记录凝胶图像以备后续分析使用。

     

    四.转膜:

    转膜是将凝胶上的蛋白质迁移到膜上的一个步骤,以便进行抗体的探针检测。常用的膜材料有聚偏氟乙烯(PVDF)和硝酸纤维素(NC)。以下是转膜步骤:

    a. 准备膜:切割适当大小的膜,并将其在转膜缓冲液中湿润。

    b. 电泳后处理:取出凝胶,将其在转膜缓冲液中浸泡一段时间(通常为10-15分钟),使蛋白质迁移到膜上。

    c. 转膜装置组装:将湿润的膜放在转膜装置上,层叠在凝胶上。确保膜与凝胶之间没有气泡。

    d. 转膜操作:将转膜装置组装到转膜槽中,添加足够的转膜缓冲液,使其覆盖整个膜和凝胶。连接上正负电极,施加适当的电压,进行转膜操作。

    e. 转膜结束:当蛋白质完全转移到膜上后,停止转膜操作。取出膜并进行后续的处理。

     

    五.阻断:

    在进行抗体结合之前,需要对转膜膜进行阻断,以避免非特异性结合和减少背景信号。一般会使用牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉作为阻断剂。以下是阻断步骤:

    a. 准备阻断缓冲液:在TBST缓冲液中加入适量的阻断剂(通常为5%脱脂奶粉或1% BSA)。

    b. 阻断操作:将转膜膜放入阻断缓冲液中,轻轻摇晃,使其完全接触。

    c. 阻断时间:通常阻断操作需要1-2小时,室温进行。

     

    六.抗体孵育:

    抗体孵育是关键步骤之一,用于特异性结合目标蛋白。以下是抗体孵育步骤:

    a. 准备一次抗体:选择与目标蛋白特异性结合的一次抗体。

    b. 稀释抗体:根据供应商提供的建议或先前的优化实验,将抗体稀释到适当浓度的TBST缓冲液中。

    c. 抗体孵育:将转膜膜放入含有稀释抗体的TBST缓冲液中,使其与目标蛋白进行特异性结合。孵育温度和时间根据抗体的要求进行设定。

    d. 洗涤:在抗体孵育后,将转膜膜放入TBST缓冲液中进行洗涤,去除非特异性结合的抗体。

     

    七.二次抗体结合及探针检测:

    在经过一次抗体结合后,通常需要使用与一次抗体相对应的二次抗体进行结合,该二次抗体与一个酶、荧光染料或放射性标记结合,以提供可检测的信号。

    a. 选择二次抗体:根据一次抗体的物种来源,选择相应的二次抗体。

    b. 稀释二次抗体:根据供应商提供的建议或先前的优化实验,将二次抗体稀释到适当浓度的TBST缓冲液中。

    c. 二次抗体结合:将转膜膜放入含有稀释二次抗体的TBST缓冲液中,使其与一次抗体进行结合。

    d. 探针检测:根据二次抗体的标记物,选择合适的方法进行探针检测。例如,可以使用酶底物进行着色、荧光探针进行荧光检测,或者用放射性探针进行放射性测量。

     

    八.图像获取及分析:

    使用分析系统(如显影仪、荧光成像仪或放射性显像系)获取转膜膜上的图像,并进行后续的分析。以下是常见的图像分析步骤:

    a. 图像获取:将转膜膜放入相应的图像获取系统中,进行图像记录。

    b. 图像分析:使用图像处理软件对图像进行分析,测量蛋白质带的密度和大小。

    c. 定量分析:通过与适当的内部参考蛋白或总蛋白的相对定量比较,确定目标蛋白的相对表达水平。

     

    结果分析:

    1.信号强度:根据图像分析的结果,观察目标蛋白带在膜上的信号强度。较强的信号表示高蛋白质表达,较弱的信号可能表示低蛋白质表达。

    2.分子量大小:通过与分子量标记品对比,在凝胶上的目标蛋白带迁移位置来估计其分子量大小。

    3.特异性:确保只有目标蛋白带出现信号,而其他非特异性结合的蛋白不产生信号。检查其他带状信号是否与预期的目标蛋白大小和形态相符。

    4.负对照和阳性对照:分析实验中的负对照和阳性对照结果,以验证实验方法的有效性和可靠性。

    5.统计学分析:使用适当的统计学方法(如t检验或方差分析)对结果进行统计学分析,确定差异的显著性。

    需要注意的是,蛋白免疫印迹实验是一种复杂的技术,结果分析需要综合考虑实验中的多个因素,并结合之前的研究背景和目的进行解读,对于结果的进一步分析和解释,可能需要借助其他实验或技术的支持。

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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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