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    生物样本透射电镜(TEM)

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    生物样本透射电镜(TEM)

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    项目介绍

    生物透射电镜介绍:透射电镜,即透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,简称 TEM),是一种最高分辨率可达到0.1-0.2纳米的显微镜,是观察和研究超微结构的重要工具。在生物科学研究方面,透射电镜可用来观察细胞整体结构、细胞亚细胞结构,包括(植物)细胞壁、细胞膜、细胞核和各种细胞器的变化、外源物质(如病原微生物、各种纳米颗粒)与细胞的关系,如外源物质进入细胞内部的方式、在细胞内的分布情况、细胞对外界刺激的反应(包括自噬、凋亡、坏死等)。

    1. 主要用于生物样品(细胞,生物组织)材料内部形貌的分析和研究;

    2. 对样品进行包埋,超薄切片,染色等工序,制成TEM样品;

    3. 通过透射电镜观察样品内部的组织形貌。

    预约前请务必阅读

    前处理方法:

    您需要提供的样品:收集细胞/组织取样(新鲜迅速取材),置于1.5ml尖底离心管内,加入预冷的终浓度为2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛固定液(固定液加到⅘离心管,使样品完全浸没在固定液中),放置于4℃过夜,请不要倒弃固定液,一般固定12h或过夜后可寄送。

    具体取材及固定方法如下:

    1.对于细胞类,106以上的细胞,用新鲜的培养液兴奋细胞,用细胞刮刀刮下来或者酶消化,加入预冷的终浓度为2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液,固定半小时,1500-3000转离心,5-10min,收集细胞于管底肉眼可见黄豆或者绿豆粒大小,弃上清,沿管壁缓慢加入4℃新的固定液,然后放入4°C冰箱过夜。

    2.对于组织类,新鲜取材,取材位置准确,组织大小尽量在1-2mm³(长1-5mm×宽1mm×高1mm),离体取材后请尽快投入4℃预冷的固定液中,然后放入4°C冰箱固定过夜。

    3.对于细菌类,吸取OD0.5-0.8的培养物,加入预冷的终浓度为2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液,固定半小时,3000-5000转离心,5-10min,离心后弃上清,收集菌体沉淀于管底黄豆大小,可以用预冷的pH7.2的PB洗1-2次,弃上清,沿管壁缓慢加入新的4℃预冷的固定液,然后放入4°C冰箱过夜。

    样本编号建议按照字母或数字来,标记清晰,样本量充足。

    *固定液的量请参考上图,加至箭头所示位置,细胞、细菌、真菌样品用尖底离心管

    *如为其他特殊样品,需要特殊的固定方式和前处理方式,请与工作人员沟通确认。

    项目案例

    样品要求

    1. 样品需要用戊二醛固定,一般固定2小时即可冰袋运输(特殊样品需要固定时间长一些),戊二醛的量要多,样品管保留一定量的空气。

    2. EP管用封口膜封好(防止管口漏液),EP管外用泡沫包好,避免低温冰冻造成样品结冰。

    3. 样品中固体含量至少一颗芝麻粒大小,细胞和菌类要米粒大小;生物新鲜组织样品取材到相应浓度的戊二醛固定液里,不益超过1min,以便较少自融,戊二醛需要预冷4-10℃再使用;

    4. 一般送样方式为4℃冰袋冷藏运输,冷冻送样需要在订单中特别指明。

    5. 该项目不支持回收,请自行留样。

    6. 可测试细菌、细胞、生物组织等样品。

    7.请尽量注明图片标尺或具体需要拍摄的内容,可输出10um、5um、2um、1um、500nm、200nm和100nm的标尺;如未注明,实验室不接受因标尺问题导致的免费补拍或重拍。

    常见问题

    Q1、为什么通过光镜(免疫荧光等)和分子实验(ELISA/WB等)观察到自噬、凋亡等现象,摸索出信号最强的时间点取材,结果电镜下细胞不是结构烂就是没有期待的结构呢?可能的原因有哪些?

    答:光镜和分子水平的变化与超微结构变化不完全平行!是基本上从来都不准确同步的,所以已经做了其他实验后想来看自噬和凋亡的,不一定能看到,铁死亡、外泌体等都有这个问题。

    可能的原因有:

    1.光镜分辨率不够,看上去阳性的东西,可能根本不在预期结构上。比如,线粒体相关的某标记物,光镜下看到胞质里阳性颗粒很多了,结果电镜下完全没有。精细实验后发现标记的其实是某些溶酶体。

     2.生理或病理过程本身的原因。比如有老师来看凋亡,给了荧光照片,胞核标记物超级清楚,结果电镜下细胞很烂。也有给了WB结果,选的阳性最强的时段取材,结果电镜下细胞完好。他们都是同一板细胞分取的。可能分子结果反映的是表达没有,表达了不见得正在发挥作用,形态还是好的。荧光都看到了,那细胞崩裂已经开始,镜下就好不了。

    Q2、动物普通组织取材、送样

    取材原则:切薄并尽快投入固定液;注意下述要求。

    1. 请尽快固定。动物组织最好在离体后1 min内开始固定。

    2. 非灌注的组织,厚度不超过4 mm,请用恰当方式(比如切宽薄片)体现位置和层次关系。尽量不要事先切成很小的颗粒。

    3. 请用锋利薄刀片切组织,朝一个方向划,不要来回切割,不要挤压、拉扯。

    4. 含有食物残渣(如消化道)、大量血液(如心肌)或其它黏附物(如乳腺等)的组织,请用生理盐水快速漂洗,再投入固定液。

    5. 请保证固定液量充足。固定液和组织的体积比不小于20 : 1。

    6. 最初的30 min以后,最好在4 ℃的固定液中浸泡,严禁结冰(太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰。冬季宁可常温送样)。

    备注:

    (1)组织尺寸和容器关系(只装一个的参考标准):

    芝麻到绿豆大小(如小鼠肾上腺):请用1.5 ml EP管;

    黄豆大小(小鼠肾脏):请用5 ml离心管;

    铺展面积类似蚕豆大小的组织片:请用平底的25 ml广口瓶;

    (2)每个容器含有N个组织时:容器体积要适当增大,组织不要相互挤压变形。

    Q3、培养细胞常规简易取材、送样?

    1. 最好刮取细胞,收集在离心管中,1500 rpm离心5 ~ 10 min(该参数可按自己的经验调整,目的是不损伤细胞结构的情况下去掉培养液成分)。

    2. 弃上清,加入固定液重悬细胞。

    3. 细胞悬液尽快(1分钟内,久了离心难以紧固)转移至1.5 ml尖底EP管,立即以10000 r/min离心12 min(该参数适用于一般小型台式离心机,不可随意更改,务必使细胞离紧不散);离紧后的细胞约半颗绿豆大小,切不可太大。

    4. 静置15 min,然后小心弃上清,再沿管壁缓慢加入室温或4 ℃固定液(不可冲击、吹散细胞)。

    5. 在4 ℃保存或运输。严禁结冰(太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰。冬季宁可常温送样)。

    备注:

    (1)对细胞表面结构没有特殊观察要求的动物细胞,均可按本法操作,比如精子、血液、脱落细胞等。薄壁细菌也可按本法处理。

    (2)观察细胞连接的实验,严禁用消化的方法收集细胞。

    (3)不耐受高速离心的样品,请以悬液送样。尽可能装满,以减少运输途中的震荡。

    (4)厚壁真菌等离心紧固后不易渗透的样品,也请以悬液送样,要求同上。

    Q4、固定液类型及介绍?

    大多数动物组织和培养细胞,提供2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。专门观察神经髓鞘的,提供3%戊二醛+Plus辅剂(临用前5 min内混合);观察厚壁真菌或细菌芽孢等,提供K-T固定液。具体根据样本类型选择合适的固定液,并非完全统一。

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