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项目介绍

生物透射电镜介绍：透射电镜，即透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称 TEM），是一种最高分辨率可达到0.1-0.2纳米的显微镜，是观察和研究超微结构的重要工具。在生物科学研究方面，透射电镜可用来观察细胞整体结构、细胞亚细胞结构，包括（植物）细胞壁、细胞膜、细胞核和各种细胞器的变化、外源物质（如病原微生物、各种纳米颗粒）与细胞的关系，如外源物质进入细胞内部的方式、在细胞内的分布情况、细胞对外界刺激的反应（包括自噬、凋亡、坏死等）。

1. 主要用于生物样品（细胞，生物组织）材料内部形貌的分析和研究；

2. 对样品进行包埋，超薄切片，染色等工序，制成TEM样品；

3. 通过透射电镜观察样品内部的组织形貌。

预约前请务必阅读

前处理方法：

您需要提供的样品：收集细胞/组织取样（新鲜迅速取材），置于1.5ml尖底离心管内，加入预冷的终浓度为2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛固定液（固定液加到⅘离心管，使样品完全浸没在固定液中），放置于4℃过夜，请不要倒弃固定液，一般固定12h或过夜后可寄送。

具体取材及固定方法如下：

1.对于细胞类，106以上的细胞，用新鲜的培养液兴奋细胞，用细胞刮刀刮下来或者酶消化，加入预冷的终浓度为2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液，固定半小时，1500-3000转离心，5-10min，收集细胞于管底肉眼可见黄豆或者绿豆粒大小，弃上清，沿管壁缓慢加入4℃新的固定液，然后放入4°C冰箱过夜。

2.对于组织类，新鲜取材，取材位置准确，组织大小尽量在1-2mm³（长1-5mm×宽1mm×高1mm），离体取材后请尽快投入4℃预冷的固定液中，然后放入4°C冰箱固定过夜。

3.对于细菌类，吸取OD0.5-0.8的培养物，加入预冷的终浓度为2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液，固定半小时，3000-5000转离心，5-10min，离心后弃上清，收集菌体沉淀于管底黄豆大小，可以用预冷的pH7.2的PB洗1-2次，弃上清，沿管壁缓慢加入新的4℃预冷的固定液，然后放入4°C冰箱过夜。

样本编号建议按照字母或数字来，标记清晰，样本量充足。

*固定液的量请参考上图，加至箭头所示位置，细胞、细菌、真菌样品用尖底离心管

*如为其他特殊样品，需要特殊的固定方式和前处理方式，请与工作人员沟通确认。

项目案例

TEM观察纳米颗粒在细胞内具体的结合位点

锈菌的TEM图

动物组织的TEM图

某细菌的TEM图

样品要求

1. 样品需要用戊二醛固定，一般固定2小时即可冰袋运输（特殊样品需要固定时间长一些），戊二醛的量要多，样品管保留一定量的空气。

2. EP管用封口膜封好（防止管口漏液），EP管外用泡沫包好，避免低温冰冻造成样品结冰。

3. 样品中固体含量至少一颗芝麻粒大小，细胞和菌类要米粒大小；生物新鲜组织样品取材到相应浓度的戊二醛固定液里，不益超过1min，以便较少自融，戊二醛需要预冷4-10℃再使用；

4. 一般送样方式为4℃冰袋冷藏运输，冷冻送样需要在订单中特别指明。

5. 该项目不支持回收，请自行留样。

6. 可测试细菌、细胞、生物组织等样品。

7.请尽量注明图片标尺或具体需要拍摄的内容，可输出10um、5um、2um、1um、500nm、200nm和100nm的标尺；如未注明,实验室不接受因标尺问题导致的免费补拍或重拍。

常见问题

Q1、为什么通过光镜（免疫荧光等）和分子实验（ELISA/WB等）观察到自噬、凋亡等现象，摸索出信号最强的时间点取材，结果电镜下细胞不是结构烂就是没有期待的结构呢？可能的原因有哪些？

答：光镜和分子水平的变化与超微结构变化不完全平行！是基本上从来都不准确同步的，所以已经做了其他实验后想来看自噬和凋亡的，不一定能看到，铁死亡、外泌体等都有这个问题。

可能的原因有：

1.光镜分辨率不够，看上去阳性的东西，可能根本不在预期结构上。比如，线粒体相关的某标记物，光镜下看到胞质里阳性颗粒很多了，结果电镜下完全没有。精细实验后发现标记的其实是某些溶酶体。

2.生理或病理过程本身的原因。比如有老师来看凋亡，给了荧光照片，胞核标记物超级清楚，结果电镜下细胞很烂。也有给了WB结果，选的阳性最强的时段取材，结果电镜下细胞完好。他们都是同一板细胞分取的。可能分子结果反映的是表达没有，表达了不见得正在发挥作用，形态还是好的。荧光都看到了，那细胞崩裂已经开始，镜下就好不了。

Q2、动物普通组织取材、送样

取材原则：切薄并尽快投入固定液；注意下述要求。

1. 请尽快固定。动物组织最好在离体后1 min内开始固定。

2. 非灌注的组织，厚度不超过4 mm，请用恰当方式（比如切宽薄片）体现位置和层次关系。尽量不要事先切成很小的颗粒。

3. 请用锋利薄刀片切组织，朝一个方向划，不要来回切割，不要挤压、拉扯。

4. 含有食物残渣（如消化道）、大量血液（如心肌）或其它黏附物（如乳腺等）的组织，请用生理盐水快速漂洗，再投入固定液。

5. 请保证固定液量充足。固定液和组织的体积比不小于20 : 1。

6. 最初的30 min以后，最好在4 ℃的固定液中浸泡，严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰。冬季宁可常温送样）。

备注：

（1）组织尺寸和容器关系（只装一个的参考标准）：

芝麻到绿豆大小（如小鼠肾上腺）：请用1.5 ml EP管；

黄豆大小（小鼠肾脏）：请用5 ml离心管；

铺展面积类似蚕豆大小的组织片：请用平底的25 ml广口瓶；

（2）每个容器含有N个组织时：容器体积要适当增大，组织不要相互挤压变形。

Q3、培养细胞常规简易取材、送样？

1. 最好刮取细胞，收集在离心管中，1500 rpm离心5 ~ 10 min（该参数可按自己的经验调整，目的是不损伤细胞结构的情况下去掉培养液成分）。

2. 弃上清，加入固定液重悬细胞。

3. 细胞悬液尽快（1分钟内，久了离心难以紧固）转移至1.5 ml尖底EP管，立即以10000 r/min离心12 min（该参数适用于一般小型台式离心机，不可随意更改，务必使细胞离紧不散）；离紧后的细胞约半颗绿豆大小，切不可太大。

4. 静置15 min，然后小心弃上清，再沿管壁缓慢加入室温或4 ℃固定液（不可冲击、吹散细胞）。

5. 在4 ℃保存或运输。严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰。冬季宁可常温送样）。

备注：

（1）对细胞表面结构没有特殊观察要求的动物细胞，均可按本法操作，比如精子、血液、脱落细胞等。薄壁细菌也可按本法处理。

（2）观察细胞连接的实验，严禁用消化的方法收集细胞。

（3）不耐受高速离心的样品，请以悬液送样。尽可能装满，以减少运输途中的震荡。

（4）厚壁真菌等离心紧固后不易渗透的样品，也请以悬液送样，要求同上。

Q4、固定液类型及介绍？

大多数动物组织和培养细胞，提供2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。专门观察神经髓鞘的，提供3%戊二醛＋Plus辅剂（临用前5 min内混合）；观察厚壁真菌或细菌芽孢等，提供K-T固定液。具体根据样本类型选择合适的固定液，并非完全统一。

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