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冷冻电镜的基本原理与应用

来源：本站时间：2020-08-24 16:36:41 浏览：20269次

作者：Green dinosaur

1 引言

先进电子显微技术为从微观基础上解析宏观物质的性质提供了有力的技术支持，但受限于电子显微镜的工作原理，以及含大量水分的生物样品的特殊性，它在生物科学研究领域的应用受到了严重限制。冷冻电子显微技术（Cryo-electron microscopy, Cryo-EM）的现世为这一局限填补了空白，采用样品冷冻——低剂量电子断层扫描——三维重构的方案，科学家们顺利得到了大分子生物样品的电子显微相。而随着硬件仪器和解析软件的发展，冷冻电镜的图像分辨率大大提升，应用范围也得到了进一步扩展，不仅限于生物材料结构研究，还可用来广泛研究对电子束、热敏感的特殊材料。冷冻电镜也将于未来在材料科学研究领域里开辟出一片崭新的天地。

2 前世今生——冷冻电子显微技术的历史

2017年10月4日，诺贝尔化学奖被授予冷冻电镜领域的3位科学家，以褒奖他们在“开发冷冻电镜用以高分辨率测定溶液中生物分子的结构”方面的贡献。这条消息甫一公布，就引起了人们的调侃，称：“冷冻电镜是授予物理学家的化学奖以奖励他们对生物领域的杰出贡献。”这一奖项的颁布将冷冻电子显微带入了大众的视野，更体现了生物与物理、数学和计算机技术的多学科融合带来的技术突破。

回顾冷冻电子显微镜的诞生历程，我们会发现多学科技术融会贯通所带来的神奇灵感碰撞。

图1 2017年诺贝尔化学奖获得者

2017年诺贝尔化学奖获得者

1924年，“物质波”假说的提出奠定了电子显微技术的基础，经过长足的发展与应用，以扫描电子显微镜（SEM）与透射电子显微镜（TEM）为主的电子显微仪器在对样品的结构解析与微观成分表征都发挥了强大的实力，但却在生物材料领域碰了壁，这是由于：

（1）高能入射电子束会对生物样品造成辐射损害，严重破坏样品的结构；

（2）生物样品中通常含有丰富的水分，在高真空环境下水分脱出会严重破坏电子束传播，同时造成样品结构的崩塌；

（3）生物样品主要由C、O、N、H等轻质元素组成，成像衬度很低，产出图像的质量受到了限制。

20世纪50年代，人们采用负染色技术来固定生物结构并对其进行电镜观察。这种实验方法操作简单，图像衬度高，但获得的电镜照片分辨率只能达到十几埃左右。

1974年，Kenneth A.Taylor和Robert M.Glaeser在-120℃观察生物样品时成功获取了冷冻水合过氧化氢酶的高分辨图像信息^[2]。这个工作中发现了冷冻样品有助于减低样品的辐照损伤，标志着冷冻电镜应用于生物物理学领域的开始。

1980年，Jacques Dubochet在薄膜纯水玻璃化的制备技术上取得了突破性的进展^[3]。他采用的液态乙烷浴冷冻法具有快速高效的优点，一直沿用至今。

由于透射电镜只能获得二维投影图像，需要建立算法逻辑，搭建起二维图像与三维结构的映射关系。

1968年，Aaron Kulg提出了从二维图像重构三维物体的基本数学原理，也称中心界面定理，奠定了三维重构技术的基础^[4]。

1987年，Max Radermacher和Joachim Frank等人提出了断层扫描成像法和单颗粒分析法^[5]。单颗粒分析技术能够严格控制对样品的辐照损伤，是今天冷冻电镜领域广泛使用的大分子结构解析方法的基础。

2008年，加州大学洛杉矶分校的周正洪教授通过一万两千多张单颗粒图像，成功获得了3.9Å分辨率的CPV病毒三维结构^[6]。这是第一次通过单颗粒冷冻电镜重构技术得到近原子分辨率的结构。

2013年以来，由于电子直接探测器（Direct electron-detector device，DDD）的发展，冷冻电镜取得了革命性的进步。加州大学旧金山分校程亦凡教授研究组成功利用新一代DDD相机解析得到了瞬时受体电位通道蛋白（TRPV1）的3.4Å分辨率结构^[1]。这项研究打破了不结晶膜蛋白侧链的分辨率屏障，展示了单颗粒冷冻电镜在膜蛋白分析上的巨大潜力。

3 庐山真面——冷冻电子显微镜的原理与结构

冷冻电子显微技术的发展与完善经历了复杂而艰辛的探索，下面，我们将深入解析冷冻电子显微镜的工作原理、流程与仪器结构，揭开它的庐山真面目。

3.1工作原理

3.1.1 样品制备：样品快速冷冻技术

样品的原位冷冻固定处理是低温电子显微镜标本制备的第一步，其过程如下图所示^[7]。

图2 原位冷冻固定示意图

原位冷冻固定示意图^[7]

冷冻电镜采用的快速冷冻技术关键在于“快速”。这是由于：采用常规冷冻手段，水分子会在氢键作用下形成冰晶，一来会改变样品结构，二来在成像过程中，冰晶体会产生强烈的电子衍射掩盖样品信号。而当冷冻速率足够快时，水分子在形成晶体之前就会凝固成无定形的玻璃态冰，具有非晶态特性，保证了在电子束探测成像的过程中不会对样品成像造成干扰。

冷冻固定时，样品首先放置在由液氮冷却的容器中，随后被快速浸入液态乙烷中。采用液态乙烷作为冷冻剂的目的是为了使冷冻速率足够快，在冷冻过程中，样品将以每秒104至106 K的速度被快速冷却。生物样品中的水被玻璃化冷冻后，样品结构就得到了保持和固定，同时玻璃化冰也不会在真空环境中挥发，在一定程度上保护了样品免受电子辐射的损伤。

3.1.2 样品成像：低剂量辐照成像

普通的样品材料在进行TEM表征时，电子剂量越高，成像质量越好。但生物样品受到的辐照损伤却是和累积的辐照总剂量相关的。更详细一点说，随着辐照剂量的增加，辐照损伤对高分辨细节的破坏更严重。因此，为了尽可能地获得更多的细节，就必须要对样品采用用低剂量辐照成像。

在冷冻电镜技术中，常用的低剂量辐照成像法有两种：冷冻电子断层扫描法，单颗粒分析成像法。

（1）电子断层扫描技术（cryogenic computed tomography）

图3 电子断层扫描技术示意图

电子断层扫描技术示意图^[8]

（2）单颗粒分析法（Single particle analysis, SPA）

单颗粒技术获得投影的具体方法如图4：制备很多具有同样结构的大分子样品，将其进行分散冷冻后进行随机的投影拍照，再通过计算模拟测定角度，对具有相同角度的粒子进行组合，突出其中更特殊、更容易解释的特征。

单颗粒冷冻电镜是针对单个粒子进行重构的技术，但我们的研究对象往往是多构象或结构异质的蛋白，颗粒之间存在细微差别，这是一些蛋白质无法获得高分辨结构的重要原因之一。对于结构异质性样品的分析，我们需要首先将样品分成几个同质的子集，然后分别进行三维重建。

由于单颗粒分析法理论成像分辨率更高，尤其在分析具有同质性结构的样品时表现出更方便、更优异的成像能力，因此得到了更广泛的应用。单颗粒分析法的研究对象可以是具有某种对称性的颗粒，也可是不具有任何对称性的蛋白分子或复合体，尤其是针对核糖体的表征。

图4 单颗粒分析图像重建

单颗粒分析图像重建^[9]

（3）电子断层扫描技术与单颗粒分析法的比较：

单颗粒分析法：

优点：解析生物大分子的理论分辨率可达原子级；样品受总辐射值小；对称颗粒的解析分辨率更高；分子量越大，结果越好；

缺点：对样品的重复性有非常苛刻的要求，只能用于对经过提纯的结构稳定的生物大分子的三维重构。

电子断层扫描技术：

优点：简单直接；对样品的要求较低；常用于对细胞或者生物组织结构的三维重构；

缺点：对同一样品位置多次拍照时，电子束对样品的辐照损伤就成为了比较严重的问题；样品旋转角度受到电子束透过样品厚度能力的限制。

3.1.3 三维重建

透射电子显微镜所成图像是物体的投影像，类似于X射线光片。通过使用投影切片定理（图5），可以组合从一个视角范围拍摄的物体的许多图像（2D投影）来生成物体的三维重建。

在理想的单颗粒成像条件下，玻璃冰中的蛋白质随机分布，如果使用了大量的粒子图像，则可以实现各向同性的重建。这与电子断层扫描相反，电子断层扫描由于样品的几何形状而限制了视角，从而实现了各向异性的重建。

图5 三维结构的傅里叶反演重建原理

三维结构的傅里叶反演重建原理^[11]

3.2 工作流程

单颗粒冷冻电镜的工作流程如下：

第１步：样品制备。高纯度、高浓度的蛋白样品溶液被滴在一个特制的样品载网上。载网由一张布满小孔的超薄非晶碳薄膜和金属支撑框架组成，在表面张力的作用下，微孔上会形成一层跨孔的薄水膜。将多余溶液吸走后，把载有蛋白溶液超薄膜的载网迅速投入到液态乙烷冷冻剂中使其快速冷冻，从而使蛋白质分散固定在玻璃态的冰膜中。

第２步：电镜图像采集。选择最有可能产生最佳图像的最佳颗粒密度和玻璃态冰厚度的样品，设定最佳的参数（比如：欠焦值、放大倍数和电子剂量等），记录这些样品区域的大量图像，用手工或半自动程序框取那些离散的分子形成的投影图。

第３步：三维结构搭建。由于电子可能对非常敏感的样品造成辐射损伤，所以单颗粒冷冻电镜只能采用非常低的电子量，而这种电镜2D投影图像有非常大的背景噪声。为提高图像分辨率，研究人员首先需要提出一个初始的3D模型，然后对捕获的单颗粒2D图像进行分选。

3.3 仪器结构

冷冻电子显微镜的仪器结构与透射电子显微镜的基本结构相似，只是在进样之前搭载了液态乙烷罐与冷冻仓，保证在样品快速冷冻后能够即刻转移至样品仓内。

图7 冷冻电镜的仪器结构

冷冻电镜的仪器结构

（1）冷冻室：在实际操作中，向液态乙烷中投入样品时，乙烷会在样品周围快速沸腾，形成绝缘气态膜，减慢向低温液体的热传递，称为莱顿弗罗斯特效应。因此要使厚度超过几微米的样品中的水以足够高的冷却速度产生非晶冰非常困难。冷冻室中加入旋转叶片真空泵将冷冻剂泵入，可以提高冷却速度。

（2）电子枪：产生电子束的部分，聚光镜系统负责将电子束聚焦到样本样品上。

（3）图像生成系统：由物镜，中间和投影仪镜头以及可移动平台组成。

（4）图像记录系统：收集来自样品的电子信号，在荧光屏上形成图像。

3.4 优势与不足

冷冻电镜已经能解析出生物大分子的原子级分辨率（0.2-0.3 nm）结构，但是这一结果离物理极限还有较大距离。并且基于生物大分子样品的成像特殊性，目前依然存在如下不足。

（1）样品制备的困难。样品制备的关键要求是颗粒朝向必须是随机分布的，但样品制备过程操作会对颗粒的随机分布造成影响。

（2）要求样品结构均一性。多个颗粒的图像数据必须进行合并和平均以形成3D重构图，若要实现高分辨率，就必须保持样品结构的均一。

（3）蛋白颗粒构象多样。理论上说，单颗粒冷冻电镜的一大优势就在于能区别不同的功能构象，但是有时候不同的构象相似度太高，导致区别起来非常棘手。

（4）成像理论需要进一步研究。冷冻电镜现有的成像理论是一种数学上的近似法。如果要进一步提高结构解析的分辨率，就需要用到更为复杂的电镜成像理论来提取图像。近年来，在单颗粒分析中取得重大突破的是最大似然估计理论，它在图像匹配、2D和3D分类与模型优化上均有应用，是一个强有力的理论工具。但过多的计算资源消耗阻碍了这个方法在冷冻电镜单颗粒重构中的广泛应用，如何在加快计算速度的同时，提高模型重构的准确性是最大似然估计算法的一个重要问题。

4 大显神通——冷冻电子显微技术的应用

4.1 结构生物学

从历史维度上看，冷冻电镜技术在结构生物学领域的功勋建树无需赘述。2020年年初，新型冠状（2019-nCoV）病毒疫情席卷全球，冷冻电镜技术在解析病毒结构、推测其侵染人体细胞的路径等传播原理发挥了重要作用，为人类攻坚疫情防护、研发疫苗提供了重要的理论依据。

图8 2019-nCoV病毒与SARS病毒的结构比较

2019-nCoV病毒与SARS病毒的结构比较^[10]

病毒要进入人体细胞，就必须与人体细胞上相应的受体蛋白结合。新冠肺炎疫情暴发以来，新冠病毒表面与宿主细胞作用的关键刺突蛋白（S蛋白，Spike glycoprotein）备受各研究团队的重视。得克萨斯大学的McLellan研究组采用冷冻电镜技术，获得纯化S蛋白的3207张照片，结合已经公开的新冠病毒序列，获得了经过3D重建的分辨率为3.5 Å的S蛋白三聚体结构^[10]。

研究团队将新冠病毒的结构与其他几种冠状病毒进行了比较。如图8，发现2019-nCoV的S蛋白整体结构与SARS病毒S蛋白的整体结构相似，各个结构之间具有高度同源性。它们之间最大的差异是RBD在其各自的“向下”结构中的位置差异。

结合冷冻电镜获取的病毒结构与表面等离子共振技术（SPR）的分析结果，研究团队表明，新冠病毒的S蛋白结合人体ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）的亲和力要远高于严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）的S蛋白，这解释了为什么新冠病毒传染性要比SARS病毒强得多。

4.2 材料科学

Stanford的崔屹教授2017年10月在Science发表了一篇使用低温电镜观察电池中锂负极材料和界面精细研究的文章，这是冷冻电镜在材料学研究中应用的一个开端^[11]。

锂枝晶是锂电池中最大的安全隐患，但锂元素非常活泼、对环境敏感的特质使得从原子层面解析锂枝晶的生长机理成为一个极具挑战的课题。传统的TEM电子束能量很高，会严重损坏枝晶结构，受到冷冻电镜观察敏感生物材料的启发，崔屹教授等人使用冷冻电镜技术首次获得了锂枝晶原子分辨率级别的结构图像。

图9 锂金属直径的原子分辨率级别TEM图像

锂金属直径的原子分辨率级别TEM图像^[11]

与传统电镜观察到的不规则形状不同，高分辨的冷冻电镜照片中显示的锂枝晶是呈长条状的完美六面晶体，其生长行为显示其有明显的<111>优先取向，也就是说，锂枝晶生长过程中可能发生“拐弯”，但是并不会形成晶体缺陷。

崔屹教授的研究结果成功还原了锂金属在温和环境下的结构图像，更贴近现实，而且证明冷冻电镜测试技术可以有效地对脆弱、不稳定的电池材料进行高分辨率表征，例如锂硅、锂硫等，并且保持它们在真实电池中的原始状态。

5 来日可期——总结与展望

长久以来，冷冻电镜在结构生物学领域取得了巨大成功，目前，多构象蛋白的三维分类问题和生物大分子的动力学分析依然是充满挑战的研究方向，新型的算法发展也将主要围绕这些问题展开。而作为一种低信号源激发测试技术，冷冻电镜技术在一些对电子束、热敏感材料，如钙钛矿材料、某些高分子材料、水凝胶、量子点等精细结构的物理表征与机理研究中也具有巨大的应用潜力。他山之石，可以攻玉。随着硬件设备与模拟算法的改进，这项引领结构生物化学研究迈入新纪元的技术，未来必定拥有更加广阔的应用前景。

参考文献:

[1] Cryo‐electron microscopy - a primer for the non‐microscopist[J]. The FEBS Journal, 2013, 280(1).

[2] Taylor K A, Glaeser R M. Electron microscopy of frozen hydrated biological specimens[J]. Journal of Ultrastructure Research, 1976, 55(3):448-456.

[3] Dubochet J , Lepault J , Freeman R , et al. Electron microscopy of frozen water and aqueous solutions[J]. Journal of Microscopy, 1982.

[4] De Rosier D J , Klug A . Reconstruction of Three Dimensional Structures from Electron Micrographs[J]. nature, 1968, 217(5124):130-134.

[5] Radermacher M , Wagenknecht T , Verschoor A , et al. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli[J]. Journal of Microscopy, 1987, 146(Pt 2):113-136.

[6] Maofu, Liao, Erhu,et al. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy[J]. Nature, 2013.

[7] Fuest M , Nocera G M , Modena M M , et al. Cryofixation during live﹊maging enables millisecond time orrelated light and electron microscopy[J]. Journal of Microscopy, 2018, 272(2).

[8] Subramaniam S (2006) The SIV surface spike imaged by electron tomography: one leg or three? PLoS Pathog 2, e91

[9] Carroni M , Saibil H R . Cryo electron microscopy to determine the structure of macromolecular complexes[J]. Methods, 2016, 95:78-85.

[10] Wrapp D , Wang N , Corbett K S , et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation[J]. Science, 2020, 367(6483):eabb2507.

[11] Li Y, Li Y, Pei A, et al. Atomic structure of sensitive battery materials and interfaces revealed by cryo-electron microscopy[J]. Science, 2017, 358: 506-510.

[12] Bai X C , Yan C , Yang G , et al. An atomic structure of human γ-secretase[J]. Nature, 2015.

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