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项目介绍

通过转录组学的研究以揭示生物学现象或疾病发生的分子机制是高通量组学研究的一个常用策略。利用高通量测序技术在全面快速得到基因表达谱的同时，还可以通过测定的序列信息精确地分析转录本的SNP、可变剪接等序列及结构变异。

技术特点

1.除了计算基因的表达水平，更可以检测转录本的序列和构变异。

2.测序深度的增加可以获得更广的动态检测范围，能够同时鉴定和定量高丰度转录本和低丰度转录本，信号强度的跨度可达6个数量级。

3. 除了检测已知转录本的表达水平外，还能够发现新的转录本。

4. 在应用于尚无参考基因组的物种时，可以通过从头组装发现新基因。

实验流程

图中深色为该实验流程

分析流程

标准分析

（1）数据过滤及比对分析

（2）转录本拼接

高级分析

（3）差异表达基因筛选

（4）差异表达基因聚类分析

（5）使用GO/KEGG分析，推测突变基因富集在哪些代谢通路。

功能介绍

通过转录组学的研究以揭示生物学现象或疾病发生的分子机制是高通量组学研究的一个常用策略。利用高通量测序技术在全面快速得到基因表达谱的同时，还可以通过测定的序列信息精确地分析转录本的SNP、可变剪接等序列及结构变异。

项目案例

样品要求

样本要求

RNA浓度≥20ng/ul ，总量≥2ug

细胞数≥5X10⁶

常见问题

Q1、真核转录组常规建库流程

1）通过磁珠和mRNA的polyA结构将mRNA分离出来；

2）mRNA片段化；

3）mRNA反转录为双链结构，第二链cDNA合成时，其中的碱基T，被替换成U，从而达到链特异性文库的目的；

4）5’末端修复、3’末端加A；

5）加接头；

6）选择特异长度回收，一般为300bp；

7）PCR；

8）上机测序。

Q2、原核转录组测序用到哪些试剂？

1）RNA提取：Trizol Reagent；

2）核糖体RNA去除：IlluminaRibo-Zero™ Magnetic Kit；

3）文库构建：IlluminaTruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit；

4）上机测序IlluminaNextSeq™500 High Output Kit v2。

Q3、什么是小RNA测序？

Small RNA测序，研究某一物种特定组织在特定状态下的已知SmallRNA，也可发现新的或该物种的Small RNA并预测其靶基因，为研究Small RNA的功能及此物种的基因调控机制提供了有力工具。Small RNA主要包括微RNA（miRNA）、小干扰RNA（siRNA）、与piwi相互作用的RNA（piRNA）三类。

Q4、哪些物种可以研究lncRNA？

要做lncRNA分析，对物种有以下要求：

a. 物种为真核生物；

b. 物种具有参考基因组；

c. 具有较为完整的注释。

Q5、为什么CircRNA测序的研究比较热？

1）多角度阐述分子生物学问题的需要；

2）从新的角度发现导致样本存在差异的需要；

3）寻找影响疾病发生的分子标记；

4）探究circRNA的未知功能；

5）寻找导致microRNA表达发生变化的机理。

Q6、全转录组测序是怎么做的？

全转录组测序是将样品分为两份，构建2个文库，1个小RNA文库（包含miRNA）和一个去除核糖体的链特异性文库（包含mRNA，lncRNA，和circRNA），然后分别上机测序，最后主要获得4类RNA——miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA的序列信息。

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