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    WB实验中的转膜与抗体结合步骤详解
    来源: 时间:2024-01-08 09:59:01 浏览:2488次

    WB实验中的转膜与抗体结合步骤详解

     

    蛋白质免疫印迹(Western blotWB是一种检测蛋白质表达水平和分子量的技术WB实验包括样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、抗体结合及显色等多个步骤。


    一、转膜

    转膜是将SDS-PAGE电泳分离后的蛋白质转移到固定在固相支持物上的过程,转膜方法有向上毛细管转移、向下毛细管转移、电转移和真空转移等;固相支持物主要有硝酸纤维素膜和尼龙膜,硝酸纤维素膜是非共价结合,易脆,而尼龙膜是带正电荷的,高强度,不易破损,具有较大的DNA结合容量,在转膜过程中,需要将分离胶上的蛋白质完全转移到膜上,以便后续的抗体结合和检测。

    二、抗体结合

    抗体结合是WB实验的核心步骤,主要包括一抗孵育、洗涤、二抗孵育和洗涤等过程。

    1. 一抗孵育:将特异性一抗添加到转膜后的膜上,孵育过程中一抗与目标蛋白质发生结合,一抗的浓度和孵育时间需要根据实验需求进行调整;一般情况下,一抗的浓度在1:1000-1:10000之间,孵育时间为1-2小时,在孵育过程中,需要保持膜的湿润,可以使用封闭液或抗体稀释液进行湿润。

    2. 洗涤:用缓冲液(如TBST)反复洗涤膜上未结合的一抗洗涤的次数和时间需要根据实验情况进行调整,一般洗涤3-5次,每次5-10分钟;洗涤的目的是去除未结合的一抗,避免后续的显色反应受到干扰。

    3. 二抗孵育:将与一抗匹配的二抗加入到膜上,孵育过程中二抗与一抗结合,二抗的浓度和孵育时间也需要根据实验需求进行调整;一般情况下,二抗的浓度在1:1000-1:10000之间,孵育时间为1-2小时,同样需要保持膜的湿润。

    4. 洗涤:用缓冲液(如TBST)反复洗涤膜上未结合的二抗洗涤的次数和时间需要根据实验情况进行调整,一般洗涤3-5次,每次5-10分钟。

    三、注意事项

    1. 在转膜过程中,需要控制好转膜电压和时间,以及膜的湿度和尺寸,避免影响蛋白质的转移效率。

    2. 在抗体结合过程中,需要注意一抗和二抗的浓度和孵育时间,避免过度或不足结合。

    3. 洗涤步骤是去除未结合抗体的重要环节,需要充分洗涤,避免背景杂乱。

    4. 实验过程中需要保持膜的湿润,避免膜干燥影响抗体结合。

    5. 在显色过程中,需要均匀涂抹ECL显色液,避免显色不均。

     

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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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