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WB实验中的转膜与抗体结合步骤详解

来源：时间：2024-01-08 09:59:01 浏览：833次

WB实验中的转膜与抗体结合步骤详解

蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）是一种检测蛋白质表达水平和分子量的技术，WB实验包括样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、抗体结合及显色等多个步骤。

一、转膜

转膜是将SDS-PAGE电泳分离后的蛋白质转移到固定在固相支持物上的过程，转膜方法有向上毛细管转移、向下毛细管转移、电转移和真空转移等；固相支持物主要有硝酸纤维素膜和尼龙膜，硝酸纤维素膜是非共价结合，易脆，而尼龙膜是带正电荷的，高强度，不易破损，具有较大的DNA结合容量，在转膜过程中，需要将分离胶上的蛋白质完全转移到膜上，以便后续的抗体结合和检测。

二、抗体结合

抗体结合是WB实验的核心步骤，主要包括一抗孵育、洗涤、二抗孵育和洗涤等过程。

1. 一抗孵育：将特异性一抗添加到转膜后的膜上，孵育过程中一抗与目标蛋白质发生结合，一抗的浓度和孵育时间需要根据实验需求进行调整；一般情况下，一抗的浓度在1:1000-1:10000之间，孵育时间为1-2小时，在孵育过程中，需要保持膜的湿润，可以使用封闭液或抗体稀释液进行湿润。

2. 洗涤：用缓冲液（如TBST）反复洗涤膜上未结合的一抗，洗涤的次数和时间需要根据实验情况进行调整，一般洗涤3-5次，每次5-10分钟；洗涤的目的是去除未结合的一抗，避免后续的显色反应受到干扰。

3. 二抗孵育：将与一抗匹配的二抗加入到膜上，孵育过程中二抗与一抗结合，二抗的浓度和孵育时间也需要根据实验需求进行调整；一般情况下，二抗的浓度在1:1000-1:10000之间，孵育时间为1-2小时，同样需要保持膜的湿润。

4. 洗涤：用缓冲液（如TBST）反复洗涤膜上未结合的二抗；洗涤的次数和时间需要根据实验情况进行调整，一般洗涤3-5次，每次5-10分钟。

三、注意事项

1. 在转膜过程中，需要控制好转膜电压和时间，以及膜的湿度和尺寸，避免影响蛋白质的转移效率。

2. 在抗体结合过程中，需要注意一抗和二抗的浓度和孵育时间，避免过度或不足结合。

3. 洗涤步骤是去除未结合抗体的重要环节，需要充分洗涤，避免背景杂乱。

4. 实验过程中需要保持膜的湿润，避免膜干燥影响抗体结合。

5. 在显色过程中，需要均匀涂抹ECL显色液，避免显色不均。

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