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200 Da以下小分子怎么做SPR？4个关键技巧全解析

来源：时间：2026-07-15 13:33:41 浏览：645次

SPR技术不需要标记、能实时读出结合信号，也能给出K_D、K_on、K_off这些定量参数，所以小分子—靶蛋白互作研究里用得很多。但分子量一旦掉到200 Da以下，事情就开始变得麻烦：信号太弱、非特异吸附、DMSO体积效应，样样都比大分子更难搞。

测试狗科研服务整理了具体做法

把实操中最容易出问题的4个点拆开讲

为什么小分子做SPR特别难？

SPR看的是芯片表面折射率变化，而这个变化跟结合上去的质量成正比。小分子本身质量小，响应信号天然就低。葡聚糖芯片表面带负电，带电小分子容易被静电吸过去，出现假阳性信号；DMSO和运行缓冲液的折光率差异，又会在每次换液时带来bulk shift，把小分子那几RU信号进一步盖住【2,3,6】。

SPR检测原理与典型传感器响应曲线（来源：Froehlich et al., Anal. Chem., 2023【2】）

碎片筛选（FBDD）里的分子通常更小、亲和力更弱（mM 级别），对实验设计和数据质量的要求只会更高。Pascarella等人把话说得很直接：SPR的价值在于能测到这些弱而短暂的相互作用，但前提是实验设计够严谨，伪影被压到可控范围【9】。

虽然RU值本身很低，但实验中产生的RU值和偶联量、分子浓度、大小都相关，只要结合信号呈现明确的浓度依赖性，且在不同独立实验中能够稳定重现，这样的数据依然具有确凿的生物学意义。所以小分子SPR不是简单把蛋白固定、注入小分子就能拿到好数据的，芯片、缓冲液、溶剂校正、筛选标准、再生条件，每一项都得单独优化。

200 Da以下小分子做SPR的4个关键技巧

1

选对芯片和固定策略

小分子SPR首先要决定的是“把谁固定在芯片上”。常规做法是把蛋白氨基偶联固定、小分子作为分析物流过。但如果蛋白因氨基偶联产生结构变性而失活、结合位点被遮，或者蛋白和小分子质量比过大导致信号极低，就要考虑反向SPR或捕获式固定。

Lewis等人在测多发性骨髓瘤SET结构域抑制剂KTX-1001时，把生物素化的KTX-1001通过链霉亲和素固定在SA芯片上，再流过His标签的MMSET 蛋白，从而测得了K_on、K_off和K_D【1】。这样做的好处是小分子被稳定固定，蛋白保持活性、结合位点朝向溶液，绕开了蛋白直接固定可能破坏活性位点的问题。曹忠莲和杨萍在研究HSA 与小分子华法林（308 Da）时，也强调偶联前必须做pH筛选（醋酸钠缓冲液pH 4.0–5.5），找到蛋白在芯片表面的最佳固定条件，避免偶联量不足或过量【4】。

如果是His标签蛋白，Liu等人比较过tris-NTA和mono-NTA芯片，发现tris-NTA定向固定的蛋白活性比随机氨基偶联高出49%，并且经过60次再生循环仍稳定【6】。Kim等人在galectin-3糖模拟物研究中则使用CM3低容量芯片，把蛋白固定量控制在400–800 RU，降低了质量传输效应（mass transport effect）对动力学的干扰【7】。

反向SPR测定KTX-1001与MMSET结合的代表性动力学数据（来源：Lewis et al., JBC, 2025【1】）

200 Da以下小分子，SPR的芯片选择，一般可以按这三条走：优先用定向捕获芯片（NTA、SA、CAP 等），减少蛋白失活和位阻；蛋白—小分子质量比过大时，考虑反向SPR或竞争法；控制固定密度，CM3或 CM7（CM7的蛋白载量高于CM5）低容量芯片通常更合适。

2

高离子强度缓冲液压制非特异性吸附

带电小分子很容易与芯片表面的葡聚糖羧基发生非特异性静电吸附。Froehlich等人研究5-HT与适配体互作时发现，5-HT的pKa约10，在pH7.4下带正电，会被负电的葡聚糖层吸引，造成明显的非特异性结合。解决办法是提高运行缓冲液的离子强度：用1 M NaCl时，静电吸附被有效屏蔽，实测响应接近理论Rmax，信号更可信【2】。

但高盐不是没有代价。Froehlich等人报道，在1 M NaCl条件下测得的KD约为低盐条件下的10倍，也就是亲和力看起来弱一个数量级，说明高盐会改变真实的结合热力学平衡【2】。所以同一批实验必须保持所有浓度点和缓冲条件离子强度一致，不同化合物之间才有可比性。

5-HT在SPR中的传感器响应曲线，展示高离子强度缓冲液对非特异性吸附的抑制效果（来源：Froehlich et al., Anal. Chem., 2023【2】）

对于疏水性小分子，Motsa和Stahelin建议在运行缓冲液里加0.05%Tween 20，降低疏水性非特异性吸附，但浓度太高可能让蛋白变性或表面活性剂本身带来干扰，要把握好【5】。曹忠莲和杨萍也提醒，小分子SPR实验应避免使用 Tris、DTT等可能与配体或分析物相互作用的试剂，HEPES或PBS体系更稳妥【4】。

3

DMSO溶剂校正不能省

小分子水溶性差，通常要用DMSO助溶。DMSO体积分数在2%–5%是小分子筛选的常规条件【3,4】。但DMSO 的折光率和水性缓冲液差别很大，1%DMSO就能产生约1200 RU的bulk shift，浓度波动0.1%就能带来超过1 RU的基线漂移。对小分子只有几RU的真实信号来说，这个影响不能忽略【5,6】。

CD28靶向小分子高通量筛选完整工作流（含DMSO溶剂匹配与carry-over控制）（来源：Calvo-Barreiro et al., ACS Omega, 2025【3】）

曹忠莲和杨萍的HSA—华法林方案里明确写：小分子样品和运行缓冲液必须含相同浓度的DMSO，每个循环开始和结束都要做溶剂校正，消除DMSO浓度微小差异带来的体积效应【4】。Calvo-Barreiro等人在CD28小分子高通量筛选中，也采用DMSO匹配缓冲液，每轮测试后用50% DMSO水溶液清洗流路，并设置carry-over control，防止化合物残留【3】。

Motsa和Stahelin把溶剂校正称为小分子SPR数据可靠性的前提，不是可选项；所有分析物都必须溶解在含同浓度DMSO的运行缓冲液里，每个浓度点的DMSO浓度都要精确一致【5】。Pascarella等人在综述中，也把缓冲液和溶剂优化列为近年SPR碎片筛选最显著的进展之一【9】。

4

小分子专属的筛选命中标准

小分子SPR筛选不能照搬大分子“响应越高越好”的标准。首先要按分子量估算理论R_max：R_max≈（分析物分子量/配体分子量）×固定水平【2】。比如100 kDa蛋白固定1000 RU，200 Da小分子的理论Rmax只有约2 RU。这种“微弱”响应也可能代表真实结合，不能轻易放过【6】。

其次，小分子通常结合快、解离也快，一般在60秒内就能达到稳态【3】。对这类体系，稳态亲和力分析（steady-state analysis）往往比动力学拟合更稳，因为小分子信号低、解离快，单独拟合K_on/K_off容易失真【5】。曹忠莲和杨萍也指出，小分子SPR数据分析要重点关注拟合质量参数（如 Chi²）和Rmax是否合理，避免过度拟合【4】。

Calvo-Barreiro等人在CD28筛选中建立了明确的占据率（Ligand Occupancy, LO）判读标准：LO在50%–100% 之间算潜在命中；LO>200% 提示非特异性结合；参照通道响应≥5 RU就直接排除为NSB假阳性【3】。Kirkman 等人在碎片筛选方法综述中建议，SPR筛出的苗头化合物应该用NMR、ITC、DSF或热泳等正交方法交叉验证，减少假阳性【8】。Kim等人对 galectin-3糖模拟物的研究也展示了稳态K_D与动力学K_D的一致性验证，说明多方法交叉验证是有必要的【7】。

galectin-3糖模拟物的稳态K_D与动力学K_D一致性验证（来源：Kim et al., SLAS Discovery, 2023【7】）

测试狗专研小分子SPR解决方案

小分子SPR的难点从来不只是上机操作，而是信号弱、干扰多、细节复杂的系统性问题。从芯片选型（CM5还是CM7？氨基偶联还是捕获？）、固定策略优化（偶联量多少合适？DMSO溶剂校正怎么做？），到K_D/动力学数据的可靠性判断，每一个环节都需要专业经验来支撑。

测试狗SPR技术团队由分子互作方向博士领衔，核心成员均具备多年SPR/BLI/ITC/DSF等互作平台实操经验。我们不只是操作仪器，而是基于您的靶蛋白特性与小分子类型，为您设计整套可执行的互作解决方案。团队拥有Biacore GE HEALTHCARE 8k 、1k等多台SPR仪器的多年运行经验，累计完成小分子SPR项目百余项，涵盖药物候选化合物筛选、天然产物活性成分鉴定、代谢物-靶蛋白互作验证、竞争/抑制实验等多种应用场景。在数据交付标准层面，所有实验均遵循可溯源、可复现、可发表的数据交付原则，提供完整的传感器图、拟合参数、方法学描述及实验原始数据，确保数据质量符合高水平期刊发表要求。