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    Nature Cell Biology | 活细胞动态RNA成像技术
    来源: 时间:2022-12-27 10:46:03 浏览:2145次


    研究RNA成像技术的原因是什么呢?众所周知,从DNA到蛋白质的转变是以RNA为中心的一个复杂的、多阶段的过程,转录后,RNA分子开始进行剪接、定位、翻译和降解,这些步骤在空间和时间领域中都是高度协调和严格调控的,细胞内RNA的可视化技术能够帮助我们更加深入地研究代谢的过程。近期,美国加州大学圣地亚哥分校华裔科学家Gene W. Yeo在Nature cell biology 杂志上发表了一篇名为“Illuminating RNA biology through imaging”的综述文章,他带领我们回顾了RNA成像的发展历程以及各种成像技术在RNA代谢中的作用,并对RNA成像的趋势进行了讨论与展望。


    RNA成像技术在固定细胞和活细胞中都在快速发展。在固定细胞中,目前的方法已经取得了高通量的成像,并能够定位和定量整个转录组的表达水平;在活细胞中,成像是低通量的,这个限制是由于每种颜色只能对应一种基因,但活细胞RNA成像的优势是通过成像分辨率的提高能够加深我们对RNA代谢动态的理解。
    在固定细胞中,对于单分子的RNA成像,包括荧光原位杂交(FISH),滚环扩增(RCA-FISH),RNAscope,杂交链反应(HCR)-FISH和交换反应(saber)-FISH。1982年,Singer和Ward,通过结合的肌动蛋白信使RNA(mRNA)与2‘-脱氧尿苷-5’-三磷酸(dUTP)的DNA探针结合,首次证明了荧光原位杂交(FISH)。1998年,利用互补DNA(cDNA)寡核苷酸合成了单分子FISH(smFISH)。2008年,该方法被进一步改进,通过用48个DNA探针探测每个mRNA,每个探针都标记为单荧光色素,以单分子分辨率检测mRNA。滚环扩增(RCA)-FISH的原理是先杂交并将挂锁探针连接到特定的mRNA靶点,然后扩增挂锁探针。
    在smFISH和RCA-FISH的基础上,为了进一步提高检测效率,提高亮度,降低总体成本。各个科研团队陆续开发了RNAscope,杂交链反应(HCR)-FISH和交换反应(saber)-FISH。RNAscope利用了多个平行的一级、二级和三级DNA寡核苷酸探针。杂交链反应(HCR)-FISH8和交换反应(saber)-FISH9分别用发夹探针和串联体放大初级探针,再沿初级探针铺设荧光二级探针。
    在固定细胞中,对于多路RNA成像,主要包括组合FISH和原位测序。组合FISH为每个独特的RNA目标分配一个“光谱条形码”,条形码中的每个位在特定的一轮成像中对应于一个特定的荧光色素,增加条形码中的位数,可以指数级地增加可以检测到的唯一转录本的数量,MERFISH和seqFISH的后续开发都能够检测到10000个独特的RNA靶点。2013年,原位测序(ISS)技术利用RCA-FISH和连接测序(SBL)来扩增和读取条形码,并确定靶mRNA的位置。随着探针设计的改进,导致了一个新的条形码系统——基于杂交的ISS(HybISS),这种新方法改进了RNA转录的空间检测。荧光原位RNA测序(FISSEQ)尝试对所有RNA进行无偏不倚的单分子测量。FISSEQ不是与挂锁探针杂交,而是与随机六聚体引物杂交。在多路RNA成像方法中,一个很有前景的新思路是使用在空间条形码载玻片上捕获的RNA。例如,最近开发的Seq-Scope利用下一代测序(NGS)化学,从捕获的RNA中生成簇仅为0.5-0.8μm。


    表1.目前固定细胞中RNA成像方法的比较
    活细胞中RNA的成像分为外源性成像和内源性成像。活细胞的外源性成像包括荧光标记的RNA,RNA茎环系统和荧光生成的RNA三类技术。1997年,Glotzer和他的同事将荧光标记的RNA微注射到果蝇卵母细胞中,以研究其短程和长程运输。1998年,Singer和他的同事开发了RNA茎环系统,以可视化酿酒酵母中定位于芽尖的ASH1mRNA。该系统由两个质粒组成,其中一个质粒编码一种绿色荧光蛋白(GFP),与单链RNA噬菌体衣壳蛋白MS2的编码序列融合,也称为MS2外壳蛋白(MCP)。第二个质粒表达一个报告基因RNA,其中包含一个目标蛋白的编码序列,然后是6个MS2结合位点(MBSs)。除MS2外,还出现了其他RNA茎环系统,包括PP7、λN、U1A和BglG。在这些系统中,茎环的长度从15到29个核苷酸不等,其蛋白质结合伙伴的大小从22到129个氨基酸,MS2/PP7系统相对抗光漂白,MS2系统可以通过基因整合到内源性基因中,以研究活鼠脑组织中的mRNA动态。2011年,Jaffrey和同事报道了一种模仿GFP的RNA适配体。在GFP中,这三个残基Ser65-Tyr66-Gly67形成了一个荧光团结构,4-羟基苯甲基咪唑啉酮(HBI)。基于这一原理,作者通过指数富集(SELEX)对配体进行了系统进化,发现了一种RNA适配体,它可以包裹HBI,导致荧光。这三种方法是最早在活细胞中可视化RNA的方法之一,并阐明了RNA生物学的多个方面,但这些系统的一个缺点是无法成像内源性的、非转基因的mRNA。
    活细胞的内源性成像包括化学合成探针和基因编码的探针。1996年,Tyagi和Kramer发明了一种名为“分子信标”的单链寡核苷酸探针,杂交后在目标RNA时发出荧光,这就是分子信标探针。另一种可视化内源性RNA的系统涉及在RNA合成过程中将荧光标记的dUTP合并到RNA中,该系统的一个局限性是因为荧光标记的dUTP可以整合到任何RNA中,所以它不能跟踪特定的RNA。关于基因编码探针,2016年,作者的实验室团队证明,通过RCas9与GFP融合,在活细胞中的RNA跟踪是可能的。2017年,Zhang和他的同事证明了Cas13a可以被设计成靶向哺乳动物RNA,并展示了催化活性Cas13a(dCas13a)与GFP融合的活细胞RNA成像。图1.亚细胞RNA成像技术发展史


    RNA成像技术的进展增加了我们对RNA整个功能生命周期(转录、剪接、定位、翻译和降解)的理解。在转录阶段,使用MS2系统的活细胞RNA成像可以检测多种转录特性,亚细胞RNA成像不仅可以回答转录过程中的关键问题,并且转录位点活细胞RNA成像的技术可以促进我们理解转录机制。在剪接阶段,从时间尺度上,剪接的时间在20秒到几分钟不等,RNA的剪接是选择性剪接,将其进行成像,可以有助于理解选择性剪接在亚细胞定位中的精确作用。在定位阶段,RNA定位错误与多种神经退行性疾病有关,转录组测序研究已经确定了这些定位错误的mRNA。空间转录组学和活细胞RNA成像的出现使我们有了在更高的空间和时间分辨率下研究mRNA错误定位的能力。在翻译阶段,活细胞成像可以理解翻译的时间动态,而固定细胞RNA成像可以在更广泛的范围内研究翻译动态。结合smFISH和o-丙炔-嘌呤霉素的新生蛋白染色显示,肠上皮细胞的整体mRNA定位发生极化,导致翻译效率的极化。在降解阶段,降解被认为是一种诱导和维持RNA定位的机制。在rnp中运输的mRNA通常被保护不降解,确保正确传递到目的地。未来具有高时空分辨率的研究工具将有助于阐明RNA降解和定位之间的相互作用。图2.RNA成像技术在生命科学领域带来的多个亮点


    随着固定细胞的mRNA成像已经从单一靶点发展到转录组规模,成像速度和图像分析仍然是亚细胞mRNA定位研究的瓶颈。人工智能在自动化细胞分割、RNA定位分配和斑点检测和跟踪方面的努力,将进一步推动我们目前对RNA定位的理解。除了扩大mRNA种类的数量外,成像内源性小RNA,如miRNA和RNA异构体的能力将大大提高我们对亚细胞分辨率下的RNA生物学的理解。RNA的加工不仅涉及RNA,还涉及DNA和蛋白质,将RNA成像与DNA和RBP成像相结合,将极大地提高我们对RNA生物学的理解,回答诸如染色体组织如何影响基因表达以及RNPs如何形成和组织等问题。此外,与高通量筛选研究的整合,如大规模RBP-RNA相互作用和CRISPR筛选,也将扩展我们的工具箱,以探索多维度的RNA。图3.RNA生物学多维方法的展望。



    教授介绍:


    Gene W. Yeo
    Gene W. Yeo博士,是加州大学圣地亚哥分校(UCSD)的细胞和分子医学教授,基因组医学研究所的创始成员,UCSD干细胞计划和摩尔斯癌症中心的成员。Yeo博士是一位计算和实验科学家,为RNA生物学和治疗学做出了贡献。他的主要研究兴趣是了解RNA加工的重要性以及RNA结合蛋白(RBP)在发育和疾病中的作用。他的实验室开创了人类疾病相关系统中的计算算法和实验方法,以进行系统和大规模的研究。Yeo博士撰写了160多篇同行评审的出版物,包括神经变性,RNA处理,计算生物学和干细胞模型领域的特邀书籍章节和评论文章;并担任两本关于RNA结合蛋白生物学的书籍的编辑。
    参考文献:
    Le, P., Ahmed, N. & Yeo, G.W. Illuminating RNA biology through imaging. Nat Cell Biol 24, 815–824 (2022).


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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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