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技巧分享:免疫电镜测试的样本制备要点
来源: 时间:2024-08-02 09:30:35 浏览:1613次

技巧分享:免疫电镜测试的样本制备要点

 

免疫电镜测试(Immunoelectron Microscopy,简称IEM)是一种高精度的实验技术,结合了电子显微术和免疫标记技术,用于在纳米级别观察细胞、组织及生物大分子的超微结构;该技术因其高分辨率和强大的穿透力,在生命科学研究中扮演着重要角色。

以下将详细介绍免疫电镜测试的样本制备要点:

一、样本的选择与固定

1. 样本选择:选择新鲜、无污染的样本是成功制备免疫电镜样本的前提;对于不同类型的样本,如细胞、组织切片或病毒颗粒,需采用不同的处理方法。

2. 固定剂的选择:常用的固定剂有戊二醛和多聚甲醛;戊二醛适用于固定细胞和组织的超微结构,多聚甲醛则更适用于抗原定位。

3. 固定过程:固定时需注意固定剂的浓度、温度和固定时间通常,4%戊二醛在4°C下固定过夜效果最佳。

二、脱水与渗透

1. 脱水:脱水是样本制备的关键步骤,通常使用乙醇或丙酮系列进行脱水;每级脱水时间不宜过长,以免样本变形。

2. 渗透:渗透剂常用环氧树脂或聚二甲基硅氧烷(PDMS;渗透过程中需注意温度和时间,确保树脂充分渗透到样本内部。

三、包埋与切片

1. 包埋:将渗透好的样本包埋在环氧树脂中,然后进行聚合;聚合过程中需控制温度和时间,以保证树脂充分聚合。

2. 切片:使用超薄切片机切取50-70nm的切片,切片应无皱褶、无刀痕。

四、免疫标记

1. 抗体选择:选择特异性强、亲和力高的抗体是免疫标记成功的关键;一抗和二抗需经过验证,确保其可靠性。

2. 标记方法:常用的免疫标记方法有免疫金标记和免疫铁标记;免疫金标记具有更高的分辨率和灵敏度。

3. 标记过程:标记过程中需注意抗体稀释度、孵育时间和温度通常,4°C下孵育过夜可获得较好效果。

五、后处理与观察

1. 后处理:免疫标记后的切片需进行后处理,如清洗、干燥和染色;常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅。

2. 观察:将处理好的切片置于透射电镜下观察;观察时需调整电压、电流和聚焦,以获得清晰的图像。

六、常见问题与解决方法

1. 样本脱落:可能由于脱水、渗透不充分或切片过厚;解决方法为优化脱水、渗透步骤,切取适当厚度的切片。

2. 免疫标记不清晰:可能由于抗体浓度不当、孵育时间不足或样本固定不良;调整抗体浓度、延长孵育时间或优化固定步骤可改善。

3. 背景染色过深:可能由于染色时间过长或染色剂浓度过高;适当缩短染色时间或降低染色剂浓度可减轻背景染色。

4. 切片皱褶或撕裂:可能由于切片过厚、刀片不锋利或操作不当;切取适当厚度的切片,确保刀片锋利,操作时轻柔、稳定。

 

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全部 3小时前 四川
文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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