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技巧分享：免疫电镜测试的样本制备要点

来源：时间：2024-08-02 09:30:35 浏览：1990次

技巧分享：免疫电镜测试的样本制备要点

免疫电镜测试（Immunoelectron Microscopy，简称IEM）是一种高精度的实验技术，结合了电子显微术和免疫标记技术，用于在纳米级别观察细胞、组织及生物大分子的超微结构；该技术因其高分辨率和强大的穿透力，在生命科学研究中扮演着重要角色。

以下将详细介绍免疫电镜测试的样本制备要点：

一、样本的选择与固定

1. 样本选择：选择新鲜、无污染的样本是成功制备免疫电镜样本的前提；对于不同类型的样本，如细胞、组织切片或病毒颗粒，需采用不同的处理方法。

2. 固定剂的选择：常用的固定剂有戊二醛和多聚甲醛；戊二醛适用于固定细胞和组织的超微结构，多聚甲醛则更适用于抗原定位。

3. 固定过程：固定时需注意固定剂的浓度、温度和固定时间；通常，4%戊二醛在4°C下固定过夜效果最佳。

二、脱水与渗透

1. 脱水：脱水是样本制备的关键步骤，通常使用乙醇或丙酮系列进行脱水；每级脱水时间不宜过长，以免样本变形。

2. 渗透：渗透剂常用环氧树脂或聚二甲基硅氧烷（PDMS）；渗透过程中需注意温度和时间，确保树脂充分渗透到样本内部。

三、包埋与切片

1. 包埋：将渗透好的样本包埋在环氧树脂中，然后进行聚合；聚合过程中需控制温度和时间，以保证树脂充分聚合。

2. 切片：使用超薄切片机切取50-70nm的切片，切片应无皱褶、无刀痕。

四、免疫标记

1. 抗体选择：选择特异性强、亲和力高的抗体是免疫标记成功的关键；一抗和二抗需经过验证，确保其可靠性。

2. 标记方法：常用的免疫标记方法有免疫金标记和免疫铁标记；免疫金标记具有更高的分辨率和灵敏度。

3. 标记过程：标记过程中需注意抗体稀释度、孵育时间和温度；通常，4°C下孵育过夜可获得较好效果。

五、后处理与观察

1. 后处理：免疫标记后的切片需进行后处理，如清洗、干燥和染色；常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅。

2. 观察：将处理好的切片置于透射电镜下观察；观察时需调整电压、电流和聚焦，以获得清晰的图像。

六、常见问题与解决方法

1. 样本脱落：可能由于脱水、渗透不充分或切片过厚；解决方法为优化脱水、渗透步骤，切取适当厚度的切片。

2. 免疫标记不清晰：可能由于抗体浓度不当、孵育时间不足或样本固定不良；调整抗体浓度、延长孵育时间或优化固定步骤可改善。

3. 背景染色过深：可能由于染色时间过长或染色剂浓度过高；适当缩短染色时间或降低染色剂浓度可减轻背景染色。

4. 切片皱褶或撕裂：可能由于切片过厚、刀片不锋利或操作不当；切取适当厚度的切片，确保刀片锋利，操作时轻柔、稳定。

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