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如何进行冷冻切片检测?步骤详解
来源: 时间:2024-12-16 10:14:43 浏览:1655次

如何进行冷冻切片检测?步骤详解

 

冷冻切片检测是一种在病理学和生物科学研究中广泛使用的技术,它允许快速制备组织样本以进行形态学分析、免疫组化免疫荧光等实验。

以下是详细的步骤介绍,包括从取材到分析的整个过程:

1. 取材与速冻

新鲜取材:迅速从生物体中获取组织样本,以减少死后变化对组织结构和抗原活性的影响。

组织处理:将组织块平放于特制容器内,如软塑瓶盖或小盒,直径约2cm,对于小组织块可加入OCTOptimal Cutting Temperature)包埋剂,以保持组织形态。

速冻:使用液氮或干冰-丙酮混合物快速冷冻组织,确保组织迅速冰结成块,减少冰晶损伤。

2. 切片准备

恒冷箱切片:将冷冻的组织块置于切片机的冷冻台上,调节至适宜温度(-15℃至-20℃),使用专用刀片进行切片,厚度通常控制在4-10微米。

组织贴片:切好的薄片需立即贴附在预冷的载玻片上,确保组织片的完整性和位置固定。

3. 固定与处理

固定:切片后,室温晾干,然后用冷丙酮固定10分钟,以稳定细胞结构和抗原。

洗涤:用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次,每次5分钟,去除固定剂。

抗原修复:对于某些需要抗原修复的实验,将切片置于特定的修复液(如EDTA)中,通过微波或煮沸处理,恢复被固定剂封闭的抗原位点。

4. 阻断与封闭

内源性酶抑制:使用3%过氧化氢溶液在室温下避光孵育25分钟,以减少内源性过氧化物酶的干扰。

封闭:用BSA(牛血清白蛋白)或正常动物血清在组织周围画圈封闭,防止非特异性结合,室温下封闭30分钟。

5. 抗体孵育

一抗孵育:将切片置于含有适当稀释的一抗的溶液中,4°C孵育过夜,以确保充分结合目标抗原。

二抗结合:洗涤去除未结合的一抗后,加入标记的二抗(如HRP或荧光标记),室温孵育一定时间。

6. 显色与染色

DAB显色或荧光染色:对于DAB显色,经过二抗处理后,使用DAB试剂显色,观察到棕色沉淀即为阳性反应。对于荧光染色,直接观察荧光信号。

核染色:通常使用DAPI进行核染色,以提供细胞核的定位信息。

7. 结果观察与分析

干燥与封片:切片干燥后,使用中性树胶或其他封片剂封片,防止荧光淬灭。

显微镜检查:在荧光显微镜或光学显微镜下观察,记录图像,分析抗原分布或细胞结构特征。

注意事项

温度控制:整个过程中,特别是切片和固定步骤,温度控制至关重要,以避免组织损伤和抗原损失。

操作精细:每一步操作都需细致,避免组织片的损坏或抗原的非特异性结合。

标准化流程:确保每一步的条件(如固定时间、抗体浓度)标准化,以提高实验的可重复性。

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全部 3小时前 四川
文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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