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‌细胞热迁移分析技术cetsa的具体原理和实验流程
来源: 时间:2024-11-29 11:29:19 浏览:9716次

‌细胞热迁移分析技术cetsa的具体原理和实验流程

 

一、基本原理

细胞热迁移分析技术(Cellular Thermal Shift AssayCETSA是一种用于检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验技术,其基本原理是基于蛋白质的热稳定性;在细胞内,当药物与靶蛋白结合时,靶蛋白的结构会变得更加稳定,从而在升高的温度下不易发生变性,因此,与未结合药物的蛋白相比,结合了药物的蛋白在相同的温度下会有更多的未降解蛋白;这一现象可以通过测量不同温度下的蛋白降解情况来观察,通常使用免疫印迹(Western blotting质谱(MS等方法进行检测。

二、实验流程

1. 细胞准备

细胞培养:选择合适的细胞系,如HEK 293T细胞,进行培养;确保细胞处于良好的生长状态。

转染:如果需要,将构建好的质粒瞬时转染到细胞中,以便在细胞内表达特定的蛋白;通常使用脂质体转染试剂,按照制造商的方案进行操作。

药物处理:将细胞暴露于DMSO(对照组)或待测试的药物中,孵育一定时间(例如24小时),以确保药物充分与靶蛋白结合。

2. 细胞裂解

洗涤:收集细胞,用含有蛋白酶抑制剂(如1 mmol/L PMSF50×cocktail)的PBS洗涤细胞,以防止蛋白降解。

重悬:将细胞重悬于PBS中,调整细胞密度至2×10^7 cells/ml

3. 温度梯度处理

分装:将细胞分装到多个PCR管中,每管含有相同数量的细胞。

加热:将PCR管置于热循环器中,在不同的温度(例如37℃至67℃)下加热3分钟,使蛋白质变性;每个温度点设置至少三个重复样本,以确保结果的可靠性。

4. 细胞裂解和冻融

裂解:将加热后的细胞重悬于NP40缓冲液中,用液氮进行3次冻融循环,以彻底裂解细胞。

离心:将裂解后的细胞悬液在4℃、20,000×g离心20分钟,收集上清液;上清液中含有未降解的蛋白,而沉淀物中则是已经降解的蛋白。

5. 蛋白检测

Western blotting:取20 μL上清液,加入等量的2×SDS loading buffer,沸水浴中灭活10分钟然后进行SDS-PAGE电泳,转移到PVDF膜上,用特异性抗体进行免疫印迹,检测目标蛋白的表达量。

质谱分析:如果需要进行高通量检测,可以将上清液送至质谱公司进行蛋白质谱分析,以获得更详细的蛋白信息。

三、应用

1. 药物靶点验证

药物结合:CETSA可以验证药物是否与预期的靶蛋白结合,通过比较药物处理组和对照组的蛋白降解情况,可以确定药物与靶蛋白的结合效率。

脱靶效应:CETSA还可以用于检测药物的脱靶效应,即药物是否与非预期的蛋白结合;这有助于评估药物的安全性和特异性。

2. 蛋白-蛋白相互作用

相互作用验证:CETSA可以用于研究细胞内蛋白-蛋白相互作用,通过观察不同温度下蛋白的降解情况,可以判断两种蛋白是否发生相互作用。

相互作用强度:CETSA还可以提供关于蛋白-蛋白相互作用强度的信息,这对于理解生物过程中的调控机制非常重要。

3. 药物筛选

高通量筛选:结合质谱技术(MS-CETSA),CETSA可以用于高通量筛选潜在的药物候选物;通过大规模的温度梯度实验,可以快速鉴定出与目标蛋白结合的化合物。

四、局限性

尽管CETSA技术具有许多优点,但也存在一些局限性:

灵敏度:并非所有蛋白-蛋白相互作用都会产生明显的CETSA位移,因此某些相互作用可能难以检测。

结构信息:CETSA通常无法提供具体的结构信息,特别是当蛋白质存在多个相互作用对象时。

细胞定位:CETSA无法直接提供药物在细胞内的具体定位信息,需要结合其他技术进行进一步研究。

 

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全部 3小时前 四川
文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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