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    蛋白质免疫印迹实验WB的关键步骤精讲与演示
    来源: 时间:2024-08-14 10:16:25 浏览:1169次

    蛋白质免疫印迹实验WB的关键步骤精讲与演示

     

    蛋白质免疫印迹实验(Western Blotting, WB)是一种用于检测特定蛋白质在样品中的表达情况的技术;它结合了电泳、蛋白质转移、抗原抗体反应和显色反应等多个步骤,具有高度的灵敏性和特异性。

    一、概述

    蛋白质免疫印迹实验的基本原理是将蛋白质通过电泳分离后,转移至固相载体上,然后利用特异性抗体与目标蛋白质结合,并通过显色反应或其他检测手段揭示目标蛋白质的存在和相对含量。

    二、关键步骤

    1. 样品准备:蛋白质提取:从细胞或组织中提取蛋白质,通常使用含有去污剂和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。蛋白质定量:使用Bradford法、BCA法或Lowry法等对提取的蛋白质进行定量。

    2. 蛋白质电泳制备SDS-PAGE凝胶:根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶浓度。加样:将蛋白质样品与上样缓冲液混合后,上样至凝胶中。电泳:在电泳仪中进行电泳,蛋白质根据分子量大小在凝胶中分离。

    3. 蛋白质转移准备转移膜:通常使用PVDF膜或硝酸纤维素膜。转移装置:将凝胶、转移膜和滤纸组装在转移装置中。电转移:在转移缓冲液中,通过电场作用将蛋白质从凝胶转移至膜上。

    4. 封闭使用含牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉的封闭液封闭膜上的非特异性结合位点,减少背景信号。

    5. 抗体孵育一抗孵育:使用特异性一抗与目标蛋白质结合,通常在4°C过夜孵育。洗膜:使用TBSTPBS缓冲液洗去未结合的一抗。二抗孵育:加入带有酶标记的二抗,与一抗结合,室温孵育1-2小时。

    6. 显色反应使用化学发光底物或酶底物,通过显色反应产生信号,揭示目标蛋白质的位置和相对含量。使用X光胶片或CCD相机拍摄图像,进行定量分析。

    三、注意事项与技巧

    1. 确保样品、抗体和试剂的质量,避免交叉污染。

    2. 控制电泳和转移条件,确保蛋白质分离和转移的效果。

    3. 优化抗体孵育条件,包括抗体浓度和孵育时间。

    4. 显色反应时,注意底物的浓度和反应时间,避免过度显色。

    四、应用

    蛋白质免疫印迹实验广泛应用于基础研究、临床诊断、药物开发等领域,用于检测蛋白质的表达、修饰、相互作用等。

     

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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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