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    测试表征系列丨一文详解MTT法和CCK-8法测定细胞毒性和增殖的优劣
    来源:科学10分钟 时间:2021-07-01 14:38:03 浏览:11045次

    MTT法检测

    MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜,用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

    CCK-8法检测

    CCK-8(Cell Counting Kit-8)是一种基于WST-8(水溶性四唑盐,一种类似于MTT的化合物)的细胞增殖与活性检测试剂盒,用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测。在电子耦合试剂存在的情况下,WST被线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的甲臜染料(formazan),甲臜染料直接溶解在培养基中。细胞若增殖越多越快,则培养基的颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,生成甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值(450nm)并进行统计学计算便可以获得细胞毒性相关数据。

    CCK-8与MTT比较

    (1) CCK-8 试剂盒提供了一种灵敏度高, 操作简便, 使用安全, 重现性好的细胞增殖与活性检测方法。与传统的MTT相比, 无需有机溶剂和放射性同位素, 步骤少, 无损失, 结果准确!

    2MTT 实验生成的甲不是水溶性的, 需要使用 DMSO 等有机溶剂溶解后才能检测; CCK-8法产生的甲是水溶性的,不仅省去了溶解的步骤, 更因此而减少了该操作步骤带来的误差。

    (3)与 MTT 方法相比, CCK-8法线性范围更宽, 灵敏度更高

    (4)CCK-8法对细胞无毒性, 可以多次测定, 选取最佳测定时间。且CCK8法所用试剂在培养基中比 MTT 更加稳定, 实验效果重复性好。

    (5)MTT 具有毒性, 同时其生成的甲需要有机溶剂溶解,溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害,会对操作人员身体造成毒害,WST-8无毒, 使用中无需有机溶剂, 操作更加安全。

    6CCK-8试剂盒在 4℃避光可长期保存, 使用无需配制, 即开即用。MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效。

    CCK-8试剂使用方法

    一、 制作标准曲线(测定细胞具体数量时)

    1、 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。

    2、 按比例(例如:1/2 比例)依次用培养基等比稀释成细胞浓度梯度,一般要做 3-5 个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。

    3、 接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值, 制作出一条以细胞数量为横坐标(X 轴),OD值为纵坐标 (Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(适用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间要一致)。

    二、 细胞活性检测

    1、 在96孔板中接种细胞悬液(100µL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37 °C, 5% CO2)。

    2、 向每孔加入 10 µL 的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 OD 值的读数)。

    3、 将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

    4、 用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。

    5、 如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10 µL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

    三、 细胞增殖-毒性检测

    使用方法(以96孔板为例,其他规格培养板按实际情况安排) :

    1、 在96孔板中配制100µl的细胞悬液(通常细胞增殖实验每孔加入100µl 2000个细胞,细胞毒性实验每孔100µl 5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度等因素决定)。按照实验需要,进行培养(在 37 °C,5%CO2的条件下)预培养24小时。

    2、 向培养板加入1-10µl不同浓度的待测药物刺激。

    3、 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时) 。

    4、 每孔加入10µl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数) 。如果起始的培养体积为200µl,则需加入20µl CCK-8溶液,其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和 CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测,则需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

    5、 在细胞培养箱内继续孵育1-4小时,对于大多数情况,孵育 1 小时即可。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定,初次实验时可以在 0.5、1、2 和4小时候分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

    6、 用酶标仪测定在450nm处的吸光度,如无450nm滤光片,可以使用420-480nm 的滤光片。可以使用大于600nm的波长, 例如650nm,作为参考波长进行双波长测定。

    7、 如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10µl 0.1M 的 HCL溶液或者 1% w/v SDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

    8、 注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收可。

    活力计算:

    细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0 加药) -A(空白)] ×100

    A(加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度

    A(空白):具有培养基和 CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度

    A(0加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

    *细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

    注意事项:

    1、 使用 96 孔板进行检测,如果细胞培养时间较长,一定要注意培养基蒸发:一方面,由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发,可以采取弃用周围一圈的办法,改加 PBS,水或培养液;另一方面,可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方,以缓解蒸发。

    2、 CCK-8 检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂,例如一些抗氧化剂会干扰检测,需设法去除。

    3、 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

    4、 建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加样,溶液产生气泡,会干扰OD值读数。

    5、 当使用标准 96 孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔(100µl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于 2500 个/孔(100µl 培养基) ,且培养时间可适当延长。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

    6、 加入CCK-8溶液时,如果细胞培养时间较长,培养基颜色已变化或 PH 值变化,建议换用新鲜的培养基。

    7、 如果没有 450nm 的滤光片,可以使用吸光度在 430-490nm 之间的滤光片,但是 450nm 滤光片的检测灵敏度最高。

    8、 酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

    9、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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