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如何轻松获得生物TEM高逼格照片？（含样品前处理）

来源：测试GO 时间：2022-08-09 10:08:26 浏览：5261次

01

透射电子显微镜

透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope, 简称TEM),可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2 μm的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。

大型透射电镜(conventional TEM)一般采用80-300 kV电子束加速电压，不同型号对应不同的电子束加速电压，其分辨率与电子束加速电压相关，可达0.2-0.1 nm，高端机型可实现原子级分辨。采用透射电镜常用的50～100 kV电子束来说，样品的厚度控制在10～100 nm为宜。

由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于0.1 μm以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片（Ultrathin sectioning），常用的超薄切片厚度是50～70 nm。超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，也是研究材料类、生物类样品的基本技术，尤其是观察细胞、组织、器官等的超微结构与亚细胞结构最常用的技术，还是电镜细胞化学、免疫电镜等的关键性技术。它在生物学的发展过程中占据重要的地位，目前各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是由它提供的。

02

主要步骤及超薄切片要求

2.1主要步骤

取材→戊二醛预固定→锇酸后固定→脱水、渗透→聚合包埋→半薄切片定位→超薄切片→电子染色→透射电镜观察

2.2生物样品超薄切片要求

2.2.1 细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应；

2.2.2 切片厚度50～100 nm为宜：太薄反差低；太厚反差好，但结构重叠，电子束不能穿透；

2.2.3 切片应耐电子束的强烈照射，不变形不升华；

2.2.4 切片能够适当被染色，保证一定的反差；

2.2.5 切片均匀，无影响拍照的皱褶、刀痕或染色污染。

03

各步骤要求

3.1 取材和预固定

3.1.1 动物普通组织

一般动物组织的取材，要点一是减少缺血缺氧时间，二是减少机械损伤。麻醉或断颈处死均可，可根据实验目的和条件选择。具体如下：

（1）请尽快用戊二醛固定液预固定。动物组织最好在离体后1 min内开始固定。

（2）非灌注的组织，厚度不超过4 mm，请用恰当方式（比如切成宽薄片）体现位置和层次关系。请尽量不要事先切成很小的颗粒。

（3）请用锋利薄刀片切组织，朝一个方向划，不要来回切割，不要挤压、拉扯。

（4）含有食物残渣、大量血液或其它黏附物的组织，请用生理盐水漂洗，再投入预固定液。

（5）请保证固定液量充足。固定液和组织的体积比不小于20 : 1。

（6）最初的30 min以后，最好在4℃的固定液中浸泡，严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰，冬季宁可常温送样）。

组织尺寸和容器关系（只装一个的参考标准）：

芝麻到绿豆大小（如小鼠肾上腺）：请用1.5 ml EP管；

黄豆大小（小鼠肾脏）：请用5 ml离心管；

铺展面积类似蚕豆大小的组织片：请用平底的25 ml广口瓶；

每个容器含有N个组织时：

容器体积要适当增大；组织不要相互挤压变形。

3.1.2 动物钙化硬组织

基本的取材和预固定要求与普通组织相同。预固定充分后（至少过夜），转入EDTA脱钙固定液脱钙。脱钙务必充分，确保切片操作无障碍。

3.1.3 须灌注固定的动物组织

小型实验动物的脑深部组织、脊髓等不易快速取出固定的标本，或需要大范围、多器官取材时，可采用经心脏灌注固定。固定液最好采用2%多聚甲醛+2.5%戊二醛。需要保全心脏相关结构的实验，或者要观察肺组织充气形态的实验禁用经心脏灌注的方法。具体步骤如下：

（1）动物恰当麻醉，腹部朝上绑定在操作台上。

（2）开腹，有利于观察灌注效果。不必观察时，或某些需要保持腹腔器官原位置的实验，可直接开胸。

（3）从剑突下小心剪破膈，使肺回缩（避免剪到肺造成出血）。随后向两侧扩大破口，与腹壁切口靠近。剪断两侧肋骨，继续向头端扩展切口，直到露出心房。

（4）夹持剑突，将胸廓整体向头端外翻并固定，充分暴露心脏。

（5）用磨钝的注射针头从左心室穿刺（小型猪、猫、狗等心脏较厚实，须用尖刀稍剪破心尖组织少许再穿刺，但勿剪漏出血），针头停留在左心室内，轻推注射器确认液体未漏出；然后用止血钳将心壁和针头一并夹持住，防止针头位置移动。（此步为灌注操作的关键，针尖务必留在左心室。如果发现穿破室间隔、房室隔或心壁，须继续小心进针，直到针头进入升主动脉，然后仍夹持心脏。）

（6）灌注预热到体温的生理盐水，同时剪破右心耳放血，直到右心耳流出的液体基本不带血色。该过程控制在1 min内完成。（最好有压力控制装置。如果没有，最好采用吊瓶，瓶的悬挂高度应通过动物血压的厘米水柱数值估计。小鼠、大鼠等一般挂在高于动物身体1.5 m处。）

（7）停止盐水灌注，通过三通管换用固定液继续灌注（室温）。初始速度与盐水一致；当动物开始强烈抽搐后，降低流速，从输液器胶囊观察窗看，维持每秒2滴。小鼠建议液量30 ml，大鼠至少100 ml，猫约500 ml，并以此估计其他小动物用量。

（8）固定液灌注过程中，观察动物肢体是否充分僵硬，黏膜、内脏等是否充分褪去血色。如果灌注液用量过半仍没有这些现象，立即终止灌注，行抢救性切割取材。

（9）灌注完成后，撤去灌注器械。如果灌注成功，小心转移动物尸体到洁净托盘中。最好用浸湿固定液的双层纱布仔细覆盖动物，再覆盖一层保鲜膜，室温等待1 h。（等待1 h的目的是使组织充分定型、硬化，减少手术切割时产生的机械损伤。不确定是否灌注成功时可不等待立即取材。）

（10）常规手术取材、切割标本，浸泡固定30 min后转入4℃冰箱过夜（此步骤同普通组织取材）。

3.1.4 植物组织

植物组织取材需注意时间因素。同批实验各组应在一天中的大致同一时刻取材，否则淀粉粒等细胞内含物差异很大。植物样品固定初期常漂浮于液面，应备好压沉用的脱脂棉。具体取材要求如下：

（1）在恰当时间，用锋利剪刀剪下叶片或其他待观察结构。宽叶片务必在保留待观察区域的前提下剪小；较粗的根必须切开固定；须根或其它细小结构尽可能截短以增加渗透效果。裁剪时避免机械损伤，并注意保留判断标本方向的结构线索。

（2）组织浸入足量戊二醛预固定液（与动物组织要求相同），再用适量洁净脱脂棉压在组织上方，确保组织完全浸没在液面下。

（3）4℃固定过夜后送样。

3.1.5 细胞低速离心收集方法

本法是改良的细胞离心收集方法，细胞结构更精细，无高速离心带来的影响，细胞数量控制不佳（偏多或偏少）也不影响制样。本法也可用于血液、精液、脱落细胞等其它样品的收集。具体操作如下：

（1）最好刮取细胞，收集在离心管中，1000 rpm离心5 ~ 10 min（初次离心参数可按自己的经验调整，目的是不损伤细胞结构的情况下去掉培养液成分）。

（2）弃上清，加入常温（平时固定液4℃保存，临用前拿出复温到室温或体温）的戊二醛预固定液，重悬细胞。常温固定2 min。4℃固定也可，除微管骨架破坏以外，无显著差异。

（3）转移至1.5 ml尖底EP管，2000 rpm离心10 min。此步离心后，细胞应为约半颗绿豆大小。

（4）用吸管小心弃上清，加入室温的0.1M PB或等渗PBS，重悬细胞。再以1000 rpm离心5 ~10 min。

（5）以相同条件重复上述重悬、离心步骤，再次漂洗细胞（不要偷懒，要洗第二遍）。

（6）用吸管小心弃上清，加入预热到40℃的GT2专用溶液重悬细胞（轻轻摇匀或吹吸均可，不要有肉眼可见的大块）；立即以3000 rpm离心10 min。

（7）用吸管尽快小心弃上清；然后密闭管盖，转入4℃静置10 min（严禁结冰）。

（8）沿管壁缓慢加入戊二醛预固定液，不要冲击细胞团，静置30 min后可送样。

请在4~10℃保存或运输，严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使样品结冰，冬季宁可常温送样）。

3.1.6 细胞高速离心收集方法

本方法过去被大多数单位采用，没有“GT2”时的应急取材也可使用。但是，高速离心可能造成某些结构变形。此外，如果细胞团太小，制样过程中有损失的风险；细胞团太大，必然渗透不良，拉低该管细胞的整体制样质量。故控制细胞离心团的大小十分重要。具体操作如下：

（1）最好刮取细胞，收集在离心管中，1500 rpm离心10 min（该参数可按自己的经验调整，目的是不损伤细胞结构的情况下去掉培养液成分）。

（2）弃上清，加入用0.1 M PB稀释到1/5（体积比1:4）的3%戊二醛重悬细胞。

（3）细胞悬液尽快转移至1.5 ml尖底EP管，立即以10000 rpm离心10 ~ 12 min（该参数适用于一般小型台式离心机，不可随意更改，务必使细胞离紧不散）；离紧后的细胞约半颗绿豆大小，切不可偏差太大。

（4）用吸管小心弃上清，再沿管壁小心、缓慢加入室温或4℃预冷的固定液（不可吹散细胞），静置30 min以上。

（5）在4 ~ 10℃保存或运输。严禁结冰（太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰，冬季宁可常温送样）。

3.2双固定法

固定的目的主要是终止组织细胞的生化过程，同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内，并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏；常用双固定法，用一定浓度的戊二醛对样品预固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定。戊二醛的渗透性好，可保存蛋白质、酶活性，稳定糖元，可长时固定（低温可长达几个月）。锇酸是强氧化剂，固定脂类、膜结构，有电子染色作用。

3.3脱水

用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分，使之能与包埋剂混合。脱水要彻底，更换液体动作要迅速，脱水时间不宜过长，且固定后的样品要充分漂洗。脱水剂：乙醇、丙酮、环氧丙烷等，脱水步骤主要是逐级梯度脱水：30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步骤每次10～20 min)→100％(2～3次，每次15min)→100％丙酮(20min)

3.4渗透、包埋与聚合

3.4.1渗透

用包埋树脂或其混合液逐渐取代组织内的脱水剂，细胞内外所有的空隙被渗透填充，使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部，以便与细胞外的包埋剂同时聚合。渗透剂依次为丙酮：环氧树脂（2：1）、丙酮：环氧树脂（1：1）、丙酮：环氧树脂（1：3）、环氧树脂，37℃温箱内，每次渗透8-12h。

3.4.2包埋与聚合

将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂（常用Epon 812、Spurr、LR White等）包埋。加温在60℃聚合形成固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，制成适于机械切割的固体树脂包埋块，利于切片。

3.5超薄切片

3.5.1制刀与切片厚度

常用玻璃刀、钻石刀进行超薄切片，刀上要装水槽，并注入槽液。切片厚度50～100 nm为宜：太薄反差低；太厚反差好，但结构重叠，电子束不能穿透。

3.5.2切片步骤

切片步骤：装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片。切片应耐电子束的强烈照射，不变形不升华；切片能够适当被染色，保证一定的反差；切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀。生物组织样品在超薄切片前，还须进行半薄切片，在光学显微镜下确定所需观察的部位。

3.6染色

利用高密度的重金属染色剂（铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差。染色实质上是增大电子密度，使电镜图像灰度不同。染色方法有单染，包括铅盐单染和铀盐单染；双染色，醋酸铀染色和柠檬酸铅染色。双染色呈现结果更全面，我们一般采用的双染法进行染色。常用染色剂：醋酸铀，有微弱的放射性，主要染核酸、核蛋白、细胞核、结缔组织。柠檬酸铅，主要染膜结构、脂类、糖原等。易与CO₂反应成沉淀，染色中应采取措施避免。

双染色步骤：

双染色：醋酸双氧铀染色→漂洗→柠檬酸铅染色→漂洗→干燥。

3.7电镜观察

选取需要观察的位置，进行拍照采集图像。

04

案例展示（由测试狗提供服务支持）

4.1动物样品测试案例展示

案例1：关节软骨细胞，×4000，2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定，强渗透浸胶包埋。