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如何轻松获得生物TEM高逼格照片?(含样品前处理)
来源:测试GO 时间:2022-08-09 10:08:26 浏览:2345次


01
透射电子显微镜


透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope, 简称TEM),可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2 μm的细微结构,这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜的分辨率。

大型透射电镜(conventional TEM)一般采用80-300 kV电子束加速电压,不同型号对应不同的电子束加速电压,其分辨率与电子束加速电压相关,可达0.2-0.1 nm,高端机型可实现原子级分辨。采用透射电镜常用的50~100 kV电子束来说,样品的厚度控制在10~100 nm为宜。

由于电镜产生的电子束穿透能力很弱,必须把标本切成厚度小于0.1 μm以下的薄片才适用,这种薄片称为超薄切片(Ultrathin sectioning,常用的超薄切片厚度是50~70 nm。超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术,也是研究材料类、生物类样品的基本技术,尤其是观察细胞、组织、器官等的超微结构与亚细胞结构最常用的技术,还是电镜细胞化学、免疫电镜等的关键性技术。它在生物学的发展过程中占据重要的地位,目前各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是由它提供的。



02
主要步骤及超薄切片要求


2.1主要步骤

取材→戊二醛预固定→酸后固定→脱水、渗透→聚合包埋→半薄切片定位→超薄切片→电子染色→透射电镜观察


2.2生物样品超薄切片要求

2.2.1 细胞的细微结构保存良好,没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应;

2.2.2 切片厚度50~100 nm为宜:太薄反差低;太厚反差好,但结构重叠,电子束不能穿透;

2.2.3 切片应耐电子束的强烈照射,不变形不升华;

2.2.4 切片能够适当被染色,保证一定的反差;

2.2.5 切片均匀,无影响拍照的皱褶、刀痕或染色污染。



03
各步骤要求


3.1 取材和预固定

3.1.1 动物普通组织

一般动物组织的取材,要点一是减少缺血缺氧时间,二是减少机械损伤。麻醉或断颈处死均可,可根据实验目的和条件选择。具体如下:

(1)请尽快用戊二醛固定液预固定。动物组织最好在离体后1 min内开始固定。

(2)非灌注的组织,厚度不超过4 mm,请用恰当方式(比如切成宽薄片)体现位置和层次关系。请尽量不要事先切成很小的颗粒。

(3)请用锋利薄刀片切组织,朝一个方向划,不要来回切割,不要挤压、拉扯。

(4)含有食物残渣、大量血液或其它黏附物的组织,请用生理盐水漂洗,再投入预固定液。

(5)请保证固定液量充足。固定液和组织的体积比不小于20 : 1。

(6)最初的30 min以后,最好在4℃的固定液中浸泡,严禁结冰(太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰,冬季宁可常温送样)。

组织尺寸和容器关系(只装一个的参考标准):

芝麻到绿豆大小(如小鼠肾上腺):请用1.5 ml EP管;

黄豆大小(小鼠肾脏):请用5 ml离心管;

铺展面积类似蚕豆大小的组织片:请用平底的25 ml广口瓶;

每个容器含有N个组织时:

容器体积要适当增大;组织不要相互挤压变形。

3.1.2 动物钙化硬组织

基本的取材和预固定要求与普通组织相同。预固定充分后(至少过夜),转入EDTA脱钙固定液脱钙。脱钙务必充分,确保切片操作无障碍。

3.1.3 须灌注固定的动物组织

小型实验动物的脑深部组织、脊髓等不易快速取出固定的标本,或需要大范围、多器官取材时,可采用经心脏灌注固定。固定液最好采用2%多聚甲醛+2.5%戊二醛。需要保全心脏相关结构的实验,或者要观察肺组织充气形态的实验禁用经心脏灌注的方法。具体步骤如下:

(1)动物恰当麻醉,腹部朝上绑定在操作台上。

(2)开腹,有利于观察灌注效果。不必观察时,或某些需要保持腹腔器官原位置的实验,可直接开胸。

(3)从剑突下小心剪破膈,使肺回缩(避免剪到肺造成出血)。随后向两侧扩大破口,与腹壁切口靠近。剪断两侧肋骨,继续向头端扩展切口,直到露出心房。

(4)夹持剑突,将胸廓整体向头端外翻并固定,充分暴露心脏。

(5)用磨钝的注射针头从左心室穿刺(小型猪、猫、狗等心脏较厚实,须用尖刀稍剪破心尖组织少许再穿刺,但勿剪漏出血),针头停留在左心室内,轻推注射器确认液体未漏出;然后用止血钳将心壁和针头一并夹持住,防止针头位置移动。(此步为灌注操作的关键,针尖务必留在左心室。如果发现穿破室间隔、房室隔或心壁,须继续小心进针,直到针头进入升主动脉,然后仍夹持心脏。)

(6)灌注预热到体温的生理盐水,同时剪破右心耳放血,直到右心耳流出的液体基本不带血色。该过程控制在1 min内完成。(最好有压力控制装置。如果没有,最好采用吊瓶,瓶的悬挂高度应通过动物血压的厘米水柱数值估计。小鼠、大鼠等一般挂在高于动物身体1.5 m处。)

(7)停止盐水灌注,通过三通管换用固定液继续灌注(室温)。初始速度与盐水一致;当动物开始强烈抽搐后,降低流速,从输液器胶囊观察窗看,维持每秒2滴。小鼠建议液量30 ml,大鼠至少100 ml,猫约500 ml,并以此估计其他小动物用量。

(8)固定液灌注过程中,观察动物肢体是否充分僵硬,黏膜、内脏等是否充分褪去血色。如果灌注液用量过半仍没有这些现象,立即终止灌注,行抢救性切割取材。

(9)灌注完成后,撤去灌注器械。如果灌注成功,小心转移动物尸体到洁净托盘中。最好用浸湿固定液的双层纱布仔细覆盖动物,再覆盖一层保鲜膜,室温等待1 h。(等待1 h的目的是使组织充分定型、硬化,减少手术切割时产生的机械损伤。不确定是否灌注成功时可不等待立即取材。)

(10)常规手术取材、切割标本,浸泡固定30 min后转入4℃冰箱过夜(此步骤同普通组织取材)。

3.1.4 植物组织

植物组织取材需注意时间因素。同批实验各组应在一天中的大致同一时刻取材,否则淀粉粒等细胞内含物差异很大。植物样品固定初期常漂浮于液面,应备好压沉用的脱脂棉。具体取材要求如下:

(1)在恰当时间,用锋利剪刀剪下叶片或其他待观察结构。宽叶片务必在保留待观察区域的前提下剪小;较粗的根必须切开固定;须根或其它细小结构尽可能截短以增加渗透效果。裁剪时避免机械损伤,并注意保留判断标本方向的结构线索。

(2)组织浸入足量戊二醛预固定液(与动物组织要求相同),再用适量洁净脱脂棉压在组织上方,确保组织完全浸没在液面下。

(3)4℃固定过夜后送样。

3.1.5 细胞低速离心收集方法

本法是改良的细胞离心收集方法,细胞结构更精细,无高速离心带来的影响,细胞数量控制不佳(偏多或偏少)也不影响制样。本法也可用于血液、精液、脱落细胞等其它样品的收集。具体操作如下:

(1)最好刮取细胞,收集在离心管中,1000 rpm离心5 ~ 10 min(初次离心参数可按自己的经验调整,目的是不损伤细胞结构的情况下去掉培养液成分)。

(2)弃上清,加入常温(平时固定液4℃保存,临用前拿出复温到室温或体温)的戊二醛预固定液,重悬细胞。常温固定2 min。4℃固定也可,除微管骨架破坏以外,无显著差异。

(3)转移至1.5 ml尖底EP管,2000 rpm离心10 min。此步离心后,细胞应为约半颗绿豆大小。

(4)用吸管小心弃上清,加入室温的0.1M PB或等渗PBS,重悬细胞。再以1000 rpm离心5 ~10 min。

(5)以相同条件重复上述重悬、离心步骤,再次漂洗细胞(不要偷懒,要洗第二遍)。

(6)用吸管小心弃上清,加入预热到40的GT2专用溶液重悬细胞(轻轻摇匀或吹吸均可,不要有肉眼可见的大块);立即以3000 rpm离心10 min。

(7)用吸管尽快小心弃上清;然后密闭管盖,转入4℃静置10 min(严禁结冰)。

(8)沿管壁缓慢加入戊二醛预固定液,不要冲击细胞团,静置30 min后可送样。

请在4~10℃保存或运输,严禁结冰(太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使样品结冰,冬季宁可常温送样)。

3.1.6 细胞高速离心收集方法

本方法过去被大多数单位采用,没有“GT2”时的应急取材也可使用。但是,高速离心可能造成某些结构变形。此外,如果细胞团太小,制样过程中有损失的风险;细胞团太大,必然渗透不良,拉低该管细胞的整体制样质量。故控制细胞离心团的大小十分重要。具体操作如下:

(1)最好刮取细胞,收集在离心管中,1500 rpm离心10 min(该参数可按自己的经验调整,目的是不损伤细胞结构的情况下去掉培养液成分)。

(2)弃上清,加入用0.1 M PB稀释到1/5(体积比1:4)的3%戊二醛重悬细胞。

(3)细胞悬液尽快转移至1.5 ml尖底EP管,立即以10000 rpm离心10 ~ 12 min(该参数适用于一般小型台式离心机,不可随意更改,务必使细胞离紧不散);离紧后的细胞约半颗绿豆大小,切不可偏差太大。

(4) 用吸管小心弃上清,再沿管壁小心、缓慢加入室温或4℃预冷的固定液(不可吹散细胞),静置30 min以上。

(5)在4 ~ 10℃保存或运输。严禁结冰(太靠近冰箱后壁或冰袋运输都可能使组织结冰,冬季宁可常温送样)。


3.2双固定法

固定的目的主要是终止组织细胞的生化过程,同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内,并保护这些结构在后续的脱水、包埋等过程中不被破坏;常用双固定法,用一定浓度的戊二醛对样品预固定,漂洗后使用锇酸对样品进行后固定。戊二醛的渗透性好,可保存蛋白质、酶活性,稳定糖元,可长时固定(低温可长达几个月)。锇酸是强氧化剂,固定脂类、膜结构,有电子染色作用。


3.3脱水

用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分,使之能与包埋剂混合。脱水要彻底,更换液体动作要迅速,脱水时间不宜过长,且固定后的样品要充分漂洗。脱水剂:乙醇、丙酮、环氧丙烷等,脱水步骤主要是逐级梯度脱水:30%→50%→70%→80%→90%→95%(以上步骤每次10~20 min)→100%(2~3次,每次15min)→100%丙酮(20min) 


3.4渗透、包埋与聚合

3.4.1渗透

用包埋树脂或其混合液逐渐取代组织内的脱水剂,细胞内外所有的空隙被渗透填充,使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合。渗透剂依次为丙酮:环氧树脂(2:1)、丙酮:环氧树脂(1:1)、丙酮:环氧树脂(1:3)、环氧树脂,37℃温箱内,每次渗透8-12h。

3.4.2包埋与聚合

将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中,灌装上纯包埋剂(常用Epon 812、Spurr、LR White等)包埋。加温在60℃聚合形成固体基质,牢固地支撑整个细胞结构或组织,制成适于机械切割的固体树脂包埋块,利于切片。


3.5超薄切片

3.5.1制刀与切片厚度

常用玻璃刀、钻石刀进行超薄切片,刀上要装水槽,并注入槽液。切片厚度50~100 nm为宜:太薄反差低;太厚反差好,但结构重叠,电子束不能穿透。

3.5.2切片步骤

切片步骤:装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片。切片应耐电子束的强烈照射,不变形不升华;切片能够适当被染色,保证一定的反差;切片均匀,无皱褶、刀痕,无染色剂或其他化学物质的沉淀。生物组织样品在超薄切片前,还须进行半薄切片,在光学显微镜下确定所需观察的部位。


3.6染色

利用高密度的重金属染色剂(铀)与细胞某些微细结构或成分结合,以增加样品局部的电子散射能力,提高电镜图像反差。染色实质上是增大电子密度,使电镜图像灰度不同。染色方法有单染,包括铅盐单染和铀盐单染;双染色,醋酸铀染色和柠檬酸铅染色。双染色呈现结果更全面,我们一般采用的双染法进行染色。常用染色剂:醋酸铀,有微弱的放射性,主要染核酸、核蛋白、细胞核、结缔组织。柠檬酸铅,主要染膜结构、脂类、糖原等。易与CO2反应成沉淀,染色中应采取措施避免。

双染色步骤:

双染色:醋酸双氧铀染色→漂洗→柠檬酸铅染色→漂洗→干燥。


3.7电镜观察

选取需要观察的位置,进行拍照采集图像。



04
案例展示(由测试狗提供服务支持)


4.1动物样品测试案例展示

案例1:关节软骨细胞,×4000,2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定,强渗透浸胶包埋。

案例2:中度缺氧改变的心肌线粒体,×5000,常规固定和制样

案例3:大脑皮质星形胶质细胞,×5000,经血管灌注固定,常规制样

案例4:胃底腺分泌状态的壁细胞,×3000,常规固定和制样

案例5:小鼠胆囊上皮,×3000,常规固定和制样

案例6:小鼠肝脏低倍大视野,×700,常规固定和制样

案例7:老年小鼠肾小球滤过屏障,×5000,常规固定和制样


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全部 3小时前 四川
文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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