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流式细胞仪FCM如何区分死细胞和活细胞？

来源：时间：2023-02-01 13:47:57 浏览：2042次

流式样品中不可能完全去除死细胞，而在流式分析时又不希望有死细胞的干扰，所以如何在流式分析和流式分选时明确分辨死细胞就成为流式细胞术的一个重要研究内容。目前，有四种方法供流式分析者区分死细胞和活细胞。

对角线死细胞

活细胞能产生非特异性荧光，只是非特异性荧光信号相对于荧光素发射的荧光信号较弱。死细胞也可以产生非特异性荧光，而且死细胞产生的非特异性荧光要明显强于活细胞，有的甚至强于荧光素产生的荧光信号。非特异性荧光产生的荧光波长没有选择性，并不是局限于某一荧光波长范围，而是处于连续的波长范围，所以一般所有的荧光通道都能够接收到死细胞产生的非特异性荧光信号，而且其在所有波长范围的荧光强度相差不多，各个荧光通道接收到的死细胞的荧光强度都是处于同一个等级的。在散点图上死细胞是位于对角线上的，而且不同的死细胞，其非特异性荧光的强度不同，且差异可能很大，强度大的可能是强度小的几十倍，甚至几百倍。所以从整体来看，死细胞的非特异性荧光强度呈现出从低到高的连续性分布，表现在散点图上死细胞刚好处于对角线上，如图A所示呈线型，与活细胞群体的圆形分布有明显区别。

对角线死细胞流式图

7AAD标记死细胞

7AAD(7氨基放线菌素D）是一种经典的核酸标记染料，在流式细胞术中能够代替PI染料用于标记死细胞，以去除死细胞对于实验结果的影响。PI染料被激发后发射的荧光波长范围很大，常规FL1、FL2,FL3都能够接收到其荧光信号，所以与FITC和PE荧光素发射的荧光波长有很大程度的重叠，因此，PI染料不宜与FITC和PE共标记。而同样标记核酸的7AAD，其发射的荧光波长比较集中，一般被PerCP荧光通道接收，基本不与FITC和PE发射的荧光重叠，可以与FITC和PE共同标记样品细胞。所以，7AAD在标记死细胞方面要明显优于PI染料。7AAD的荧光信号被PerCP通道接收，所以7AAD不能与PerCP或PE-Cy5偶联的抗体共同标记样品细胞。标记7AAD不需要与其他荧光素偶联抗体同时标记，只需在流式上样前5min加入适量的7AAD于流式管中，就可上样分析。分析时将PerCP通道阴性的细胞设门显示于新的流式图中即可，此时流式图中的细胞都是7AAD阴性的活细胞。

PE-Cy5通道非标记阳性细胞

利用PE-Cy5通道非标记阳性细胞区分活细胞和死细胞时，流式图分析的顺序一般是先在FSC-SSC图中选择目标细胞所在的细胞群，将其设门，然后将门内的细胞显示于PE-Cy5-SSC散点圈中，排除PE-Cy5通道非标记阳性细胞代表的死细胞，将PE-Cy5阴性细胞设门，然后将门内的细胞显示于新的流式图内分析，这时该流式图内的细胞都是活细胞，分析或者分选时就可以尽量排除死细胞的干扰了。

PE-Cy5通道非标记阳性细胞

EMA与ViD标记死细胞

只标记分析活细胞的表面抗原分子时，用7AAD鉴别死细胞和活细胞是理想且经典的方法。但是如果分析胞内分子，如检测胞内的重要抗原分子、胞内细胞因子和胞内活化的激酶等都需要先固定样品细胞，然后用打孔剂在细胞膜上打孔，使荧光素偶联抗体能够通过细胞膜进入细胞内，与相应目标分子结合，这时7AAD就无怯鉴别死细胞和活细胞了。如果在固定细胞前标记7AAD，固定和打孔的过程可能会使7AAD发射荧光的能力丢失，如果在上样前标记7AAD，那所有的细胞都会被标记，因为7AAD也可经过小孔进入细胞内部与DNA结合。这时，就可以用EMA(ethidiummonoazaide)和胺反应性活性染料(aminereactiveviability dye,ViD)代替7AAD在分析胞内分子时用于鉴别死细胞和活细胞。