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    精选干货丨光学表面等离子共振仪SPR技术应用合集来了
    来源:测试GO 时间:2023-02-16 14:06:58 浏览:5387次

    发展历史

    表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)起源于上世纪初,是一种新型光学检测技术。它能简单快捷的监测DNA与蛋白质之间、蛋白质与蛋白质之间、药物与蛋白质之间、核酸与核酸之间、抗原与抗体之间、受体与配体之间等等生物分子之间的相互作用,因而广泛应用于生物医药领域。

    1902年,Wood等人在一次光学实验中,首次发现了SPR现象并对其做了简单的记录,但直到39年后的1941年,一位名叫Fano的科学家才真正解释了SPR现象。

    之后的30年间,SPR技术并没有实质的发展,也没能投入到实际应用中去。1971年Kretschmann等人为SPR传感器结构奠定了基础,也拉开了应用SPR技术进行实验的序幕。

    1983年,Liedberg等人首次将SPR用于抗原抗体的反应测定并取得了成功。

    1987年,Knoll等人开始研究基于SPR技术的成像设施。

    1990年,Pharmacia Biosensor AB公司(现为Cytiva公司)开发出了首台商品化SPR仪器,为SPR技术更加广泛的应用开启了新的乐章。自此,随着科技的日新月异,SPR技术逐渐完善,其检测系统也愈发成熟。


    基本结构及原理

    SPR的核心部件包括光学系统、传感器芯片、液体处理系统三个主要部分,其他的组成部分包括LED状态指示器及温度控制系统等。其中:

    光学系统的核心是能够产生和测量SPR信号的光电组分,该组分又被称为光学检测单元;

    传感器的芯片是SPR最为核心的部件。在SPR技术中必须有一个生物分子偶联在传感片上,然后用它去捕获可与之进行特异反应的生物分子。传感芯片又分为三个主要组成部分,分别是光波导耦合器件、金属膜以及分子敏感膜。

    液体处理系统包括两个液体传送泵,其中一个泵负责保持稳定流速的液体流过传感芯片表面,另一个泵负责自动进样装置中的样品传送。

    通常,当入射的p-偏振光以特定的角度在棱镜内传播到金属膜表面发生全反射现象时,光无法穿过两种介质的临界面,但会沿着临界面平行的方向产生光波,即消逝波。在发生全反射现象的同时,入射光会与金属薄膜表面的等离子体(价电子)相互作用引起电子系统的集体震荡。因库仑力的存在使得这种现象反复进行,进而形成等离子振荡,以波的形式表现即等离子波。当消逝波和等离子波的方向和频率相同时,就产生了SPR现象。

    发生SPR现象时,金属自由电子通过共振吸收光能量,导致反射光强度明显降低,此时光的入射角被称为共振角。研究发现,SPR现象的共振角的大小与金属膜电介质的折射率密切相关。在利用SPR技术检测目标物时,需要将能与待测物结合的生物靶分子键合在金属膜表面。当含有目标物的溶液经过传感器的金属膜表面时,发生目标物和生物靶分子的特异性结合反应,由此引发了金属膜表面折射率的变化,同时光路系统监测到的SPR共振角也发生变化,进一步实现对目标分析物定量的目的(图1)。


    图1 SPR的构造及原理示意图


    应用案例解析

    与传统检测分子相互作用方法相比,SPR技术具有操作简单、耗时短、灵敏度高、可以无标记地实时测量动力学数据等优点。因此,SPR应用逐渐趋向多样化,在各种生物检测(蛋白质、病毒分子等)、传感器甚至储能催化领域都有着广泛应用。下面,笔者就列举SPR近期的部分最新热点成果,带领大家一窥“庐山真面目”!


    实例1 检测蛋白-小分子间的相互作用

    原文链接:https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.2c04986

    在蛋白质中,芳香族氨基酸的残基通过各种π相互作用在调节蛋白-配体结合过程中起到关键作用,例如π-π,cation-π,和CH-π等。虽然π相互作用很早就成为蛋白质功能研究的一个热点,但是π作用机制以及作用力大小尚不清楚。其中的一个主要原因在于试验技术方法有限,无法监测由于蛋白微环境改变从而导致的π作用力变化。

    有鉴于此,荷兰格罗宁根大学Broos等人通过氨基酸衍生物策略对芳香环π电子云强度进行微改变,从而来研究并定量分析蛋白质中的π作用力。作者首先确定以LmrR蛋白作为模型来研究π-π相互作用机制及作用力大小,并选取了一系列含有氟原子取代基的色氨酸衍生物来替换LmrR蛋白中的W96位置(图2)。质谱分析确定超过95%的W96被替换成相应的色氨酸衍生物。

    采用SPR技术,作者发现随着色氨酸衍生物中氟原子取代基数量增加,衍生物标记的LmrR蛋白与芳香小分子之间的亲和力(Kd)逐渐降低。其中LmrR蛋白与Riboflavin(RBF)的亲和力降低了近70倍,表明该亲和力很大程度上取决于色氨酸芳香环上π电子云强度(图3)。

    最后,作者采用同样手段检测了膜蛋白RibU以排除蛋白类型可能造成的结果偏差性,结果与LmrR模型一致。该研究将为药物设计、酶工程和蛋白设计等提供重要的理论依据。

     

    图2 各种色氨酸衍生物标记的LmrR蛋白的晶体结构


     

    图3 LmrR蛋白与芳香小分子之间的亲和力与氟原子取代基数量的关系


    实例2 检测蛋白-蛋白间的相互作用

    原文链接:https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2021110518

    全球气候变化导致的异常低温,严重影响了农作物(水稻)的生产,培育具有异常温度耐受的品种是解决这一问题的重要途径。农作物的品种分子设计技术依赖于细胞感知温度信号的转导网络机制,细胞中温度感受器是信号网络的源头,而温度感受器如何将温度物理信号转换成化学信号,其机制尚不明晰。

    有鉴于此,中科院植物所种康等人根据分子遗传学、生理生化和生物物理学等多学科融合策略,发现水稻细胞中钙网蛋白复合物OsCRT3-OsCIPK7可以通过蛋白构象的改变感知低温物理信号,并使其转换成细胞内的生化网络信号(图4)。SPR实验数据显示低温下OsCRT3和OsCIPK7两种蛋白的特异互作增强,表现为在低温下更快的结合速率(Ka)和更慢的解离速率(Kd),结合常数KD(Kd/Ka)减小,进而增强OsCIPK7的激酶活性,从而赋予水稻更高的寒害耐受性(图5)。该研究首次发现了温度感知的新机制,即通过蛋白的构象改变感知温度信号,并产生下游的效应。该发现具有重要的理论意义,同时也为分子设计育种提供了新的基因模块资源。

     

    图4 低温诱导OsCRT3-OsCIPK7蛋白分子间相互作用改变示意图

     图5 OsCRT3和OsCIPK7两种蛋白分子间的相互作用


    实例3 SPR用于生物传感器

    原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590006422002423?via%3Dihub

    基因疗法能从根本上补充或修复缺陷基因,恢复健康基因的正常生物学功能,具有不可比拟的治疗优势。腺病毒或腺相关病毒(AAV)已经成为预防感染、严重疾病和死亡的理想基因治疗和疫苗载体。载体进入体内诱导免疫反应并建立免疫记忆需要一种具有传染性的活性病毒疫苗。然而受到病毒载体碎片干扰,精确测定病毒疫苗载体的效价浓度十分困难,进而严重影响基因药物或疫苗的生产质量控制以及精准给药。因此,迫切需要一种可准确测定病毒载体的浓度和存活力的新技术。

    有鉴于此,华中科技大学刘钢、黄丽萍团队与华中农业大学金梅林、张强团队合作,研发了一种具有纳米级多功能机器人手结构的纳米等离子体(Nano RHB)生物传感器,用于快速、无损和特异性地捕获和定量检测腺病毒颗粒。

    采用SPR技术,作者通过聚多巴胺分子在芯片表面生成了不同形状的分枝状金纳米结构。这些分支金纳米结构的功能类似于智能机器人手,从而增强SPR共振效应以提高芯片的灵敏度,同时增加表面积以提高芯片修饰效率(图6)。将这些超灵敏生物传感器集成到标准96孔板或32孔板中,可以直接监测动态结合曲线,并使用微量样品定量检测腺病毒载体或疫苗。

    此外,研究人员使用冻干技术将CAR蛋白标记的金颗粒整合到单克隆抗体修饰的Nano RHB平台上时,检测灵敏度可以进一步提高5倍,在5分钟内同时高通量检测多达96个样品,且检测灵敏度提升至100 copies/mL,比传统病毒滴度检测方法更高效快捷(图7)。

     

    图6 使用Nano RHB定量病毒颗粒原理示意图

    图7 基于CAR包覆的Nano RHB平台在5分钟内无标记检测腺病毒


    实例4 SPR用于催化

    原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2773045X22000140?via%3Dihub

    近年来,通过表面等离子体共振(SPR)来增强化学反应已成为催化领域的一个研究热点。SPR效应是金属纳米颗粒所具备的特殊光学性质,其可根据金属的成分、形状和尺寸进行调整。这种可调谐的光-物质相互作用为生物学、传感和人工光合作用领域提供了可能性。然而,当SPR金属与分子相互接触时,其SPR衰减速率会受到严重影响,相关机理的繁杂依然困扰着研究人员。

    有鉴于此,山东大学黄柏标、郑昭科团队设计了一种光辅助调控Au纳米棒几何结构的方法,合成了具有不同纵横比的Au纳米棒(Au NRs-L、Au NRs-M 和Au NRs-S),并通过单颗粒光谱技术结合宏观实验和时域有限差分模拟(FDTD),实现了对单个Au纳米棒光致缩短的原位观察以及对催化过程的原位观测。

    研究表明,在钯(Pd)离子的辅助下,纳米棒的纵向长度随光照时间逐渐缩短,而其径向长度保持不变。当将甲酸分子注入样品池时,观察到Pd-Au纳米棒的荧光(PL)猝灭,证实了Pd-Au纳米棒和甲酸分子间的电荷转移。最后,通过将单颗粒PL测量与FDTD、DFT计算相结合,阐明了SPR诱导的甲酸脱氢催化机制。这项工作有助于理解SPR衰减机制与纳米结构之间的关系,并对SPR诱导甲酸脱氢催化提供了指导。

     

    图8 光辅助设计策略示意图及不同Au纳米棒对应的光谱

     

    图9 SPR诱导HCOOH脱氢的催化机理示意图

    参考文献

    [1] Jinfeng Shao, Bastiaan P. Kuiper, Andy-Mark W. H. Thunnissen, Robbert H. Cool, Liang Zhou, Chenxi Huang, Bauke W. Dijkstra, and Jaap Broos. The Role of Tryptophan in π Interactions in Proteins: An Experimental Approach. J. Am. Chem. Soc. 2022. DOI: 10.1021/jacs.2c04986.

    [2] Xiaoyu Guo, Dajian Zhang, Zhongliang Wang, Shujuan Xu, Oliver Batisti, Leonie Steinhorst, Hao Li, Yuxiang Weng, Dongtao Ren, Jörg Kudla, Yunyuan Xu, Kang Chong. Cold-induced calreticulin OsCRT3 conformational changes promote OsCIPK7 binding and temperature sensing in rice. The EMBO Journal, e110518, 2022. DOI: 10.15252/embj.2021110518.

    [3] Rui Li, Ya Zhao, Hongli Fan, Mingqian Chen, Wenjun Hu, Qiang Zhang, Meilin Jin, Gang L. Liu, Liping Huang. Versatile nanorobot hand biosensor for specific capture and ultrasensitive quantification of viral nanoparticles. Materials Today Bio 16 (2022) 100444. DOI: 10.1016/j.mtbio.2022.100444.

    [4] Fengxia Tong, Xiangxiang Zhang, Zeyan Wang, Yuanyuan Liu, Peng Wang, Hefeng Cheng, Ying. Dai, Zhaoke Zheng, Baibiao Huang. In situ observation of photo-induced shortening of single Au nanorod for plasmon-enhanced formic acid dehydrogenation. Advanced Sensor and Energy Materials 1 (2022) 100014. DOI: 10.1016/j.asems.2022.100014.


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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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