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蛋白质免疫印迹实验（WB）的常见问题分析

来源：测试GO 时间：2022-09-07 14:16:01 浏览：3481次

1、蛋白质免疫印迹实验中蛋白样本为什么要进行还原和变性？

答：为了使样本被还原和变性，样品缓冲液中会含有十二烷基硫酸钠(SDS)和β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。SDS是一种变性剂，用来打破蛋白的高级结构，变成初级的氨基酸结构，同时以恒定的质量比包被蛋白质，使其带上负电荷。这一恒定的负电荷比是下一步凝胶电泳分离的关键。β-巯基乙醇和DTT都是还原剂，用来断开蛋白自身的二硫键，进一步使蛋白质变成线性结构，此图中简单地展示了这一过程。顺便提一下，有些抗体只能够识别目标蛋白的天然结构，在这种情况下，样本不需要被还原和变性。所以还原和变性的步骤可以省略。但是，大多数蛋白质印迹分析都需要在还原和变性的体系中进行。

蛋白质免疫印迹实验图片

2、为什么检测重组蛋白时难以获得条带？

答：抗体检测重组蛋白质时，存在难以克服的困难，有必要加以考虑。所以推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。同时，如果重组蛋白带有标签，标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的C或N末端，以降低这种情况发生的可能性（而不是位于蛋白质的阅读框中间）。

3、牛奶和 BSA 封闭有区别？

答:抗体可能对封闭剂敏感，一般来讲，BSA会产生更清晰的结果，因为BSA含有较少的蛋白，因而抗体较少与其发生交叉反应。但并非总是如此，有些抗体在牛奶中的效果更好，因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白，能封闭更多不同类型的蛋白质。

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