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    利用动态光散射 (DLS) 进行单克隆抗体测量​
    来源:药时空 时间:2022-10-26 13:55:31 浏览:2913次

    动态光散射 (Dynamic light scattering,DLS) 是一种强大的方法,适用于测量生物样品,尤其是蛋白质和生物聚合物。

    蛋白质被用作免疫分析和其他快速诊断、疫苗制造中的主要功能成分,以及广泛的可注射蛋白质药物的主要成分。


    在这些应用中的每一个中,抗体保持完整和单体是至关重要的。忽视遵循这些严格的标准会损害基于抗体的产品的可加工性、活性和稳定性。


    充分利用DLS,可以发现蛋白质的聚集,并且可以非常准确地确定单体蛋白质的大小。为了证明这一理论,将对单克隆抗体 (mAb)药物 进行的聚集研究与针对常见蛋白质血清白蛋白 (BSA) 获得的结果进行比较。


    介绍

    DLS 依赖于自由漫射材料,由于布朗运动随机传播,将在散射激光中产生快速变化的原理。这些强度波动的时间尺度需要几十纳秒到几百毫秒。这些变化与粒子的运动直接相关。获得从激光散射强度产生的信号并将其转换为自相关函数。这是测量粒度分布的基础。


    许多经常出现的球状蛋白质的流体动力学尺寸很小。蛋白质单体通常小于10nm,其中许多小至1nm或更小。需要高速相关器来测量这种快速扩散的蛋白质的大小。蛋白质聚集体可以轻松地获得数百纳米或更多的大尺寸。部分聚集蛋白质的标准样品在流体动力学尺寸上可扩展超过1-2个数量级。在这种情况下,难点在于选择合适的相关仪器以完全解析这些信号。如下所述,相关器的可配置性对于评估具有挑战性的异质生物样品至关重要。


    应该注意的是,从DLS获得的直径,通常称为流体动力学直径(dh),与扩散系数(Dt)成反比。在DLS中测量的Dt与流体动力学大小dh之间的关系是相反的,由斯托克斯-爱因斯坦方程提供:

    Dt=kBT/3πηdh


    其中玻尔兹曼常数 (kB)、温度 (T) 和体积粘度 (η) 都是既定值。这个表达式可以简化为:

    Dt∝1/dh


    光散射的惯例是将小散射角表示为前向散射,将大散射角表示为后向散射。反向散射,通常是指远大于90度的角度,非常常用于测量单体大小的小蛋白质的尺寸。相反,前向散射对较大的物种特别敏感,可用于识别甚至微量聚集蛋白质的存在。对于既定的散射角θ和折射率n,散射矢量q由以下表达式确定:

    q=4πn/λosin(θ/2)


    已建立的相关函数C(τ)被解卷积为单指数、拉伸指数或指数的总和。此目的的不同元素可分为特征衰减率 Г,通常另外还有多分散指数。该 Г 与平移扩散系数 (Dt)相关联,如下所示:

    Г=Dtq2


    对于标准的中等大小的球状蛋白质,可以看到小至数百s-1和大至50000s-1的衰减率(Г),这取决于散射角。可配置的相关器布局提高了测量如此广泛的衰减率的能力。如下图所示,对于BSA,对于既定大小的粒子,Г线性地受 q2的影响。在最可能的应用中,可以采用单个角度的DLS来求解Dt,从而获得突出显示的蛋白质的直径。常见的 DLS 配置,尤其是台式仪器,通常具有后向散射、直角和前向散射(θ=173o、90o和 15o)。

    作为散射角θ函数的血清白蛋白单体的DLS结果。有效dh=7.5nm。为了使Гvsq2相关性有用,最少需要4-5个散射角。


    反向散射可用于确定蛋白质单体的大小。通常,反向散射角有助于测量含有游离蛋白质和聚集蛋白质的样品。反向散射角减少了较大颗粒方向上的固有强度偏差,否则可能会掩盖单体蛋白质的散射。


    前向散射对聚集极其敏感。与反向散射角相比,极低的角度对大颗粒特别是那些大于1000nm的颗粒极其敏感。尽管前向散射对聚集体的存在极为敏感,但后向散射对于精确确定可能与聚集材料共存的任何小颗粒的大小更有用。

    在五个单独的散射角获得的相关函数,θ=(30,150° )。二次衰变的存在在两个最低角度变得明显。


    在反向散射中计算时,血清白蛋白看起来是单体的。如果仅在反向散射角处进行DLS 测量,则很容易将BSA的散射与纯单体的散射相混淆。在最小的角度(30和45度),第二次衰变的存在是显而易见的。向较慢扩散方向的转变,或较小的Г,表明存在较大的粒子。这表明大而缓慢移动的粒子,可以想象聚集的蛋白质,需要与单体蛋白质共存。


    BSA是一种传统的血清蛋白,经常被用作与药物相关的蛋白质(如抗体)的替代品。这种小的球状蛋白质以单体、二聚体和有时三聚体的形式存在。在生理pH值下,可能会出现极少量的BSA聚集。相比之下,抗体是大而适应性强的蛋白质,具有紧凑的亚基,由许多脆弱的内部二硫键结合在一起。化学降解的抗体可能会聚集或产生低分子量的抗体片段。


    可以使用单个角度简单地测量单体mAb。如下所示,可以在单个散射角θ=90度下有效地测量稳定的单体单克隆抗体。该测量产生大约12nm的有效直径,以及接近零的低多分散性。相关函数最好定义为单个指数衰减,这意味着样本的特征简单且均匀,没有注意到聚集。

    以90度散射角测量的稀释单克隆抗体显示单个有效直径约为11.6nm。

    化学应激单克隆抗体的DLS产生与2-3个主要成分的相关函数,其中主要成分是聚集蛋白。


    该样品(上图)显然由许多离散且定义明确的群体组成,正如对由聚集蛋白和游离蛋白组合组成的样品所预期的那样。相比之下,化学应激抗体不能以由单一衰减常数组成的模型为特征,也不能被显着标记为连续分布的粒径。由于这些Г在s-1中跨越多个数量级,因此它们只能通过谨慎选择包含各种延迟时间(高速、中速和低速通道)的相关器布局来解决。


    当采用多峰粒径分布时,只要采用适当的散射角 (θ≥90度) ,游离单体抗体峰就可以从聚集峰中完全分离出来。很明显,选择大的散射角(下图)增强了解决许多快速衰减的能力。

    作为散射角θ和散射矢量q2的函数的多峰分布的可分辨性。


    考虑选择由各种延迟时间(τ)和散射角组成的相关器布局,即使存在极度聚集的蛋白质,也可以极其精确地测量单体mAb。应注意Г1,Г2,Г3在15与155度的分辨率上的差异。


    回顾

    1、选择最佳散射角对于准确测量具有挑战性的生物样品至关重要。

    2、恒定的多角度测量可能会有所帮助,特别是当开始时聚合和单体蛋白质的未确定组合。尽管如此,这对于可靠、均质的蛋白质样品来说通常是不必要的。

    3、应该注意的是,前向散射表示非常小的角度,而后向散射表示大角度。台式仪器通常具有三个固定的散射角,前向、直角和后向散射。

    4、关键点:

    (1)背向散射有助于小颗粒或混合物的高精度测量。

    (2)低角度对较大的颗粒极为敏感;这就是前向散射有助于识别甚至少量蛋白质聚集体的原因。

    (3)前向散射角虽然有助于识别聚集,但在量化许多共存物种的大小时不太有用。


    结论

    蛋白质聚集体可以很容易地达到数百纳米或更大的大尺寸,这使本已困难的测量变得复杂。这一原理通过一种适用于药学的蛋白质、单克隆抗体(mAb) 展示,在其单体和聚集状态下进行检查。尽管它具有异质性,考虑到相关器布局和散射角的选择允许来自单体mAb的信号的全分辨率,尽管存在化学诱导的聚集体。

    来源:药时空

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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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