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    实时荧光定量PCR实验中会出现的问题有哪些?
    来源:测试GO 时间:2022-10-28 11:34:10 浏览:2851次

    在科研人员进行实时荧光定量PCR的实验操作中遇到了不计其数的问题,本文就给大家分享在实验过程中出现频率最高的一些问题:

     内参基因COL1(扩增曲线)

    一、Ct值出现

    检测荧光信号的步骤有误:一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

    1、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。

    2、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

    3、模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

    二、Ct值出现过晚(Ct>38

    1、扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。

    2PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

    3PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。

    三、溶解曲线不止一个主峰

    1、引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

    2、引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。

    3、镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。

    4、模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

    四、扩增效率低

    1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

    2、反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

    3、反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。


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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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