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实时荧光定量PCR实验中会出现的问题有哪些？

来源：测试GO 时间：2022-10-28 11:34:10 浏览：2821次

在科研人员进行实时荧光定量PCR的实验操作中遇到了不计其数的问题，本文就给大家分享在实验过程中出现频率最高的一些问题：

内参基因COL1(扩增曲线)

一、Ct值出现

检测荧光信号的步骤有误:一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

1、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。

2、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

3、模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

二、Ct值出现过晚（Ct>38）

1、扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

2、PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

3、PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。

三、溶解曲线不止一个主峰

1、引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

2、引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

3、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

4、模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

四、扩增效率低

1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

2、反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

3、反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

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