预存
Document
当前位置:文库百科文章详情
实时荧光定量PCR实验中会出现的问题有哪些?
来源:测试GO 时间:2022-10-28 11:34:10 浏览:4148次

在科研人员进行实时荧光定量PCR的实验操作中遇到了不计其数的问题,本文就给大家分享在实验过程中出现频率最高的一些问题:

 内参基因COL1(扩增曲线)

一、Ct值出现

检测荧光信号的步骤有误:一般SybrGreen法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

1、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。

2、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

3、模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

二、Ct值出现过晚(Ct>38

1、扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。

2PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

3PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。

三、溶解曲线不止一个主峰

1、引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

2、引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。

3、镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。

4、模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

四、扩增效率低

1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

2、反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

3、反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。


测试狗文库百科

评论 / 文明上网理性发言
12条评论
全部评论 / 我的评论
最热 /  最新
全部 3小时前 四川
文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
点赞12
回复
全部
查看更多评论
相关文章

一文详解扫描电子显微镜(SEM)的工作原理及应用技术

2023-10-08

热重分析(TG-DTG)曲线的几种解析方法

2023-12-26

接触角测试(CA)的原理、样品制备要求及实际应用

2023-11-16

一文详细介绍he染色的基本原理、实验步骤及注意事项

2023-11-23

恒电流间歇滴定法GITT的基本原理以及测试教程

2022-08-12

TMA技术的基本概念、应用领域以及实际操作中的要点

2023-12-06

热门文章/popular

基础理论丨一文了解XPS(概念、定性定量分析、分析方法、谱线结构)

晶体结构可视化软件 VESTA使用教程(下篇)

手把手教你用ChemDraw 画化学结构式:基础篇

【科研干货】电化学表征:循环伏安法详解(上)

电化学实验基础之电化学工作站篇 (二)三电极和两电极体系的搭建 和测试

【科研干货】电化学表征:循环伏安法详解(下)

微信扫码分享文章