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圆二色光谱仪基础知识，不会操作？简单照做就搞定！

来源：时间：2022-12-01 16:50:33 浏览：4500次

1.引言

光学活性物质对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光的吸收系数（ε）是不相等的，εL≠εR，这会使左、右圆偏振光透过后变成椭圆偏振光，这种现象称为圆二色性（Circular dichroism, 缩写为CD）[1]。

根据圆二色光谱法的原理和测试要求设计制成的仪器称为圆二色光谱仪，该仪器广泛应用于蛋白质折叠、蛋白质构象、酶动力学、配位化合物、手性化合物等的科学研究。

利用圆二色光谱仪进行分析时，所得结果常以圆二色光谱显示。圆二色光谱中的横坐标是平面偏振光的波长λ，纵坐标为吸收系数之差（Δε=εL-εR）。由于εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，摩尔椭圆度[θ]与Δε的关系为：[θ]=3300Δε，因此圆二色光谱也可以摩尔椭圆度为纵坐标，以波长为横坐标作图。

2.圆二色光谱仪的原理与结构

2.1 圆二色光谱仪的原理

光是横电磁波，是一种在各个方向上振动的射线。其电场矢量与磁场矢量相互垂直，且与光波传播方向垂直。由于产生感光作用的主要是电场矢量，一般就将电场矢量作为光波的振动矢量。光波电场矢量与传播方向所组成的平面称为光波的振动面。若此振动面不随时间变化，这束光就称为平面偏振光，其振动面即称为偏振面，如图1所示。

平面偏振光可分解为振幅、频率相同，旋转方向相反的两圆偏振光，如图2所示，圆偏振光的振幅保持不变，而方向周期性变化，电场矢量绕传播方向螺旋前进。其中电矢量以顺时针方向旋转的称为右旋圆偏振光，如图3所示，其中以逆时针方向旋转的称为左旋圆偏振光，如图4所示。两束振幅、频率相同，旋转方向相反的偏振光也可以合成为一束平面偏振光。如果两束偏振光的振幅不相同，则合成的将是一束椭圆偏振光。

此外，要想好好了解圆二色光谱仪，还需懂得何为光学活性物质，即能使射入物质的平面偏振光的偏振面旋转的物质称为旋光性物质或光学活性物质，具有手性结构的分子才具有光学活性。

2.2 圆二色光谱仪的结构

圆二色光谱仪主要由氙灯、单色器、光电调节器、样品池以及光电倍增管检测器组成，其结构简示图如图5所示。

该仪器采用氙灯作光源，光电倍增管作检测器，波长范围165～850 nm，检测范围为±3000 m°，具有波长可调、光通量大、灵敏度高、数据准确和信噪比高等优势。其中旋光色散附件包含一个可旋转的线偏振分析棱镜，其以45°角处在样品和检测器之间，来切换垂直和水平光。在圆二色光谱仪的光路上装配旋光色散附件即可进行旋光的测定，从而在手性药物研究中不需使用两种仪器[2] 。

虽然圆二色光谱仪的组成部件简单，但是在使用过程中也有需要注意的地方，以下我们以AVIV 410型圆二色光谱仪为例，简单介绍一些仪器开机调试、开机参数设置以及样品池的选择三个方面的内容：

（1）仪器开机调试：

圆二色光谱仪属于高灵敏度的光谱类仪器，仪器的自身状态和外部测试条件都会直接影响到数据的质量，因而在实际的使用过程中，由于每次仪器的状态都不一样，包括氮气气流，氙灯的稳定性，以及测试条件如温度、相对湿度也在不断地变化，这些因素都会影响测试的灵敏度和准确度。

a）在开机前需要把氮气流量调节在0.15～0.2 MPa之间通氮气30 min左右，先驱除仪器光路中的氧气及水汽，特别是氙灯产生的臭氧，它会对紫外光吸收产生干扰；

b）然后打开氙灯电源，等待“lamp ready”灯亮后，按下“ignite lamp”，点亮氙灯；

c）再打开“CPU/INST PWR”按钮，打开电脑，打开控温循环水、打开软件进行参数设置。

（2）开机参数设置：

a）波长范围设置：测试的波长范围在充分包括样品信号的情况下尽可能地远离真空紫外区，以减小环境和溶剂紫外吸收的影响；

b）谱带宽度选择：对于正常测量最佳谱带宽度是1～2 nm。需要高分辨率测量时，需用较窄的谱带宽度，此时光电倍增管的电压较高，谱的信噪比差。而对于样品的吸光度很高但CD信号很弱时，一方面要尽量保证测定CD峰所需要的足够浓度，另一方面要设置较宽的谱带，以牺牲分辨率而得到较好的信号。另外，在固体CD光谱测试时也需要较大的谱带宽度（一般要求> 2 nm）；

c）扫描速度：测试时根据需要选择合适的扫描速度，一般选择100 nm/min，在进行粗扫描决定CD信号位置时可选择比较快的扫描速度。

（3）样品池的选择：

AVIV 410型圆二色光谱仪对液体样品测试时使用两面透光的石英比色皿即可，常用的比色皿光程分为1.0 cm、5.0 mm、2.0mm、1.0 mm、0.5 mm、 0.2 mm 、 0.1 mm等规格。圆二色光谱本质上仍然是吸收光谱，因此朗伯比尔定律也适用于圆二色光谱。在一定浓度范围内，圆二色信号的强度和样品的浓度及光程成正比。一般圆二色信号较好，溶剂影响小的情况下选用1.0 cm光程的比色皿即可。但有些样品，信号较弱，就需要提高样品的浓度，浓度太大时，使用光程大的比色皿，电压会超出检测范围，这时可以选用光程小的比色皿，可以有效地减少溶剂的吸收及浓度的逆效应，达到提高检测信号的目的。检测固体样品一般用石英片即可，把样品均匀地涂在石英片上或夹在两片石英片中间固定后置于光路检测[3]。

3.圆二色光谱仪的图谱及样品要求

3.1 圆二色光谱仪的图谱

我们在引言部分提到了圆二色光谱仪的图谱，即圆二色谱。由于吸收系数之差（ Δε ）有正值和负值之分，所以圆二色谱也有呈峰的正性圆二色谱和呈谷的负性圆二色谱。在紫外可见光区域测定圆二色谱与旋光谱，其目的是推断有机化合物的构型和构象。

如图6所示的圆二色谱，其中包含的三种曲线所代表的含义如下所示：

a）当光学活性化合物对光没有特征吸收时，在谱图中仅为一条近似水平的直线；

b）当光学活性化合物对光存在特征吸收时，通常有两种情况：当εL大于εR时，得到一个正性的圆二色光谱曲线；当εL小于εR时，得到一个负性的圆二色光谱曲线。

3.2 获取理想的图谱

在用圆二色光谱仪对溶液或固体样品进行测试时，我们都想获取理想的CD谱图，为了实现这个目的，我们应该注意以下几个方面：

a）手性样品符合CD光谱测试的条件（在给定波长范围内有较强的CD信号和合适的吸收值）。必须事先测定手性样品的UV-Vis吸收光谱（溶液或固体漫反射），预测CD谱峰的可能位置和选择合适的制样浓度（对于溶液吸收光谱，A ≈ 1）；

b）提供高对映纯度的手性样品；

c）根据样品的性质选择测定方式（溶液、固体、单晶或荧光CD）；

d）对溶液样品应选用合适的溶剂、浓度和光程（与测定UV-Vis光谱类似）。对于在紫外区测试的样品建议选用较小的光程（≤0.5 cm）和截止波长足够低的溶剂，最好为高纯水或醇类溶剂；

e）对固体样品的压片法测试，应视样品的不同选用合适百分比浓度及合适的稀释剂（KBr、KCl或CsI等）研磨压片后进行透射扫描；

f）选择适当的测定参数（波长范围、扫描速度、灵敏度和狭缝等）；

g）对于同一个样品，在可能的条件下，建议同时做其溶液和固体CD光谱加以比较；

h）如果可能，最好同时做一对对映体的CD光谱，以检查其CD信号的真伪和在定量的条件下互相印证其对映纯度。

3.3 圆二色光谱仪的样品要求

a）样品必须保持一定的纯度，不含光吸收的杂质，溶剂必须在测定波长没有吸收干扰；

b）样品能完全溶解在溶剂中，形成均一透明的溶液，样品如有悬浮或沉淀，则需过滤或离心以除去沉淀；

c）在测定的光谱范围内，样品的吸光度值不应超过2.0，最优信噪比的吸光度值为0.86；

d）单晶样品：需要足够大且需合适的样品架；

e）薄膜样品：可以是透明的无机固体薄膜，也可以是有机高分子薄膜；

f）缓冲液与溶剂要求：缓冲液和溶剂在配制溶液前要做单独的检查，看是否在测定波长范围内有吸收干扰，看是否形成沉淀和胶状；在蛋白质测量中，经常选择透明性极好的磷酸盐作为缓冲体系；

g）样品浓度与池子选择：样品不同，测定的圆二色光谱范围不同，对池子大小（光径）的选择和浓度的要求也不一样；蛋白质CD光谱测量一般在相对较稀的溶液中进行；

4.圆二色光谱仪的主要技术性能优势

圆二色光谱仪的主要技术性能优势如下：

a）光通量大，特别的光学设计，大大地提高了光通量、光强度，能在全波长范围都可得到很好的信噪比，保证检测数据的真实性；

b）灵敏度高，可以检测更细微的结构信息，如带宽可以小至0.1 nm、0.01 nm，从而能在检测时得到精确、细微的指纹性结构信息；

c）样品（如有机合成物、蛋白样品等）的用量少，可以用很微小的样品池，如光程为0.01 mm（2.6 μL）、0.1 mm（26 μL）的样品池；

d）检测器的位置可以调节，在分析脂质体等高光散射类样品时，得到特别大的光通量；

e）直接分析温度相关的CD光谱信息，从而得到热力学分析信息。

5.圆二色光谱仪的主要应用

由于生物大分子基本都含有手性的基团和结构，而圆二色光谱仪可以帮助测量和观察生物大分子的结构和构象变化，因此圆二色光谱技术成为生物物理和生物化学研究中的一个非常重要的手段，被广泛应用于有机化学，生物化学，配位化学和药物化学等领域，其主要应用如下[4-5]：

a）手性结构测定：如官能团的位置及特定原子在手性分子中的位置的测定；

b）构型的测定：利用对应关系和邻近关系测定密切相关的一类化合物的相对构型；利用八区律等一类经验和半经验的规律，结合其它方法测定绝对构型；

c）手性介质（包括溶剂和手性大分子）诱导的光学活性的研究，即一个非手性分子被外部介质所诱导而产生光学活性；

d）溶剂效应：研究溶剂与溶质间的相互作用及该作用对分子的光学活性的影响；

e）圆二色光谱仪还可以用作光谱分析。

我们通过以下实例来进一步说明圆二色光谱仪在科研中的应用：

在分子生物学领域中，蛋白质溶液的圆二色谱可以反映蛋白质的立体结构信息。蛋白质是氨基酸以肽键联接而成的具有特定空间结构的生物大分子，其圆二色性表现为生色基团和折叠结构的总和。张强等人在《中华鳖裙边胶原蛋白的提取、鉴定及其理化性质》一文中利用Chirascan V100型圆二色光谱仪对胶原蛋白的微观结构进行分析[6]，实验中将冻干样品溶于0.05 mol/L的乙酸中，配制成0.3 mg/mL的胶原蛋白溶液，取少量溶液加入2 mm比色皿中，放人圆二色光谱仪中，于25 ℃，190～250 nm 的波长下扫描3次，记录各光谱曲线，结果如图7所示。

由图中可以看出，在25 ℃下ASC和PSC的特征圆二色光谱分别在224 nm和222 nm处出现正峰，这是左旋聚脯氨酸构型的圆二色谱典型特征，根据结果分析，PSC的正/负吸收峰比值较ASC大，则说明PSC比ASC的三重螺旋结构更完整。

圆二色光谱也常用于研究手性金纳米粒子的微观结构和手性来源，韦克毅等人[7]将手性金纳米粒子的CD光谱信号的变化与 Ag+的浓度相关联，这种方法既拓展了金纳米粒子的应用范围，又对Ag+的识别与检测提供了新的方法。本实验的部分结果如图8-9所示。

图8和图9分别为手性金纳米粒子溶液中加入10 μmol/L Ag+后,在 0，0.5，1.0，3.0，4.0，6.0，7.5，10，11，14，15，20和25 min时的CD光谱以及在230 nm处CD光谱强度的猝灭图。从图中可以看出，手性金纳米粒子的CD光谱强度随着Ag+的加入迅速下降，最终趋于稳定，稳定时间为12 min，从响应时间的角度考虑，该方法可以应用于Ag+的快速识别与检测[7] 。

从上述的两个实例中不难看出，圆二色光谱仪对于研究分子结构不对称性、手性结构测定等具有重要作用，在人们的生产生活中扮演着极其重要的角色。

6.参考文献

[1] 王建明. 过渡金属配合物圆二色光谱的理论解析[D]. 2008.

[2] 张林群, 李颖, 杨红晓. 圆二色光谱仪和旋光仪对手性药物比旋度测定的比较[J]. 分析仪器, 2014, 000(006):64-68.

[3] 陈木子,等. AVIV410型圆二色光谱仪的使用及维护[M]. 2003(1).

[4] 丁晓岚, 高红旗. 圆二色光谱技术应用和实验方法[J]. 实验技术与管理(10):48-52.

[5] Xiaoyan Z , Enhua C , Xueguang S . Circular dichroism spectroscopic studies on structures formed by telomeric DNA sequences in vitro[J]. Chinese ence Bulletin, 2000, 45(21):1959-1963.

[6] 张强, 黄鑫, 符安卫,等. 中华鳖裙边胶原蛋白的提取，鉴定及其理化性质[J]. 食品与发酵工业, 2019, 045(012):176-182.

[7] 韦克毅, 王猛, 杜宇,等. 基于手性金纳米粒子圆二色光谱法识别与检测银离子[J]. 厦门大学学报, 2016, 55(004):601-605.

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