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    实验笔记丨免疫组织化学染色(IHC)步骤详解
    来源: 时间:2022-11-02 15:34:07 浏览:1645次

    免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)。


    包埋组织

    在4%多聚甲醛溶液中固定组织48小时后,放入一次性组织包埋盒中脱水,浸蜡后包埋。


    修片


    修剪石蜡切片,直至将石蜡切片修到大部分组织在切面上。

    组化


    3.1 蜡块制备

    将组织蜡块提前泡到冰水混合物中使其变软,将组织蜡块放在切片机上切出5微米的切片,60°C烘片1小时。


    3.2 脱蜡

    1)将切片放到60°C烘箱中烘片4h以上。

    2)在二甲苯I里置入片子,持续0.5 h,再置于二甲苯II,依然持续0.5 h。


    3.3 水化

    1)通过酒精,浸泡切片,酒精浓度不一,分为70%、80%、90%、95%、100%,各浓度浸泡时间也有所差异,前3个浓度都是各自浸泡2分钟,后面两个浓度分别浸泡5分钟、10分钟。

    2)最后将片子放到双蒸水中浸泡2min。


    3.4 组化

    1)封闭处理:选择内源性过氧化物酶阻断剂,处理时间为20 min。

    2)用双蒸水浸泡三次,单次时间5 min。

    3)抗原修复:准备pH=6.0的10 nM柠檬酸抗原修复液400-600 ml,把片子放到里面,用保鲜膜封住烧杯口防止沸腾溢出。之后放到微波炉中用高火加热10 min。

    4)加热后用双蒸水补齐液面,在微波炉中加热40 min(中低火至解冻之间),每隔10 min用双蒸水补齐液面。

    5)修复结束后,放到室温下,使其自然冷却。

    6)DDW清洗180"之后,通过PBS清洗,3分钟/次,进行三次。

    7)通过一抗封闭,保持4°C,第二天进行温度回升,为37°C,然后通过PBS清洗,持续5分钟。

    8)在其中添加反应增强液,然后孵育,室温条件,持续20 min,再通过PBS清洗,3分钟/次,进行三次。

    9)加入增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物,然后孵育,室温条件,持续20 min,再通过PBS清洗,3分钟/次,进行三次。

    10)滴加DAB显色液(现用现配、比例1:19),室温孵育2-10 min(根据不同的抗体自行选择染色时间)。用自来水轻轻冲洗掉。

    11)复染:加苏木精染色50 s。用DDW,3 min,PBS,5min X3次。

    12)脱水:将片子依次浸泡到不同浓度的酒精梯度中:70%,lmin—80%,lmin—90%,1 min—95% I,5min—95% II ,5min—100%I,5min—100% II,5min。

    13)透明:利用二甲苯I、二甲苯 II 进行处理,每次处理持续20 min。

    14)中性树脂封片,中性树脂,加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡),自然晾干。

    来源:科研日精进

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    12条评论
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    全部 3小时前 四川
    文字是人类用符号记录表达信息以传之久远的方式和工具。现代文字大多是记录语言的工具。人类往往先有口头的语言后产生书面文字,很多小语种,有语言但没有文字。文字的不同体现了国家和民族的书面表达的方式和思维不同。文字使人类进入有历史记录的文明社会。
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