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流式细胞术与流式细胞仪FCM的测试应用场景
来源: 时间:2022-12-06 11:45:58 浏览:2466次

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机模拟计算技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度>95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

流式细胞仪FCM

流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器,已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断,对淋巴细胞群和亚群进行精确分类,还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备,染色后也能在荧光显微镜下进行观察,在某些实验条件下,活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。


流式细胞仪技术,主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过焦点时,发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置),光检测器把散射光定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后而成整数,然后进行电子存储,以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下:


1、具有操作简便,只要将染色的单个细胞推入仪器中,就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度,而且每次可测出许多数据,一般情况下,每秒可测5000个细胞,能迅速分析和记数大量细胞,并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛,即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析,也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群,既可测定DNA和RNA、测凋亡峰,又可测蛋白含量,特别是胞浆蛋白。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型(又称小型机、台式机)和综合型(又称大型机、分析型)。ECKMAN-COULTER公司的产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL等, B-D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型,除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。

流式细胞仪

流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。

主要技术指标


1.流式细胞仪的分析速度:
一般流式细胞仪每秒检测1000~ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差>5%即可区分。
3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm~0.5μm。
4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5.流式细胞仪的分选速度:一般流式细胞仪分选速度>1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上。
  主要构造和工作原理:流动室及液流驱动系统 编辑本段回目录流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动,控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成,只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向,能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而使激光激发的荧光信息准确无误。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种,供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。

主要构造和工作原理:激光光源及光束形成系统


    流式细胞仪可配备一根或多根激光管,常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管。


流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源。


    在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致。

主要构造和工作原理:光学系统

    流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔(一般为2片透镜、1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类:长通滤片(LP)--只允许特定波长以上的光线通过,短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过,带通滤片(BP)-- 只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525, 接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。

主要构造和工作原理:信号检测系统


    当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射(Forward Scatter, FS)和侧向角散射或900散射(Side Scatter, SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。
前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号;侧向角散射或900散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm)。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)、CY5(化青素)、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是:
 激发光波长(ηm) 发射光峰值(ηm)
FITC 488 525(绿)
PE 488 575(橙红)
PI 488 630(橙红)
ECD 488 610(红)
CY5 488 675(深红)
PreCP 488 675(深红)
各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。

主要构造和工作原理:信号存储、显示、分析系统

(一) 信号存储
存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的,采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。
(二)信号显示和分析
由于List mode方式数据缺乏直观性,数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。
1.单参数数据显示和分析  细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示,图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值,其单位是道数,可以是线性的,也可以是对数的;纵坐标表示细胞数。一维直方图横坐标是FITC荧光信号相对强度值(对数),纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”(直线门),仪器的计算机就会给出测定值(包括阳性细胞%和平均荧光强度)。
2.双参数数据显示和分析  细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。
3.三参数数据显示和分析  细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对(三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据)用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图(prism)表示,分光图可直接给出8个数据(如用ABC代表3种荧光,可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-)。
  主要构造和工作原理:细胞分选系统 编辑本段回目录 如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动,可带动细胞流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。

活体流式细胞仪(In vivo Flow Cytometer, IVFC)

 活体流式细胞仪(In vivo Flow Cytometer, IVFC) 是一种新的生物医学光学仪器,结合活体(近红外)实时高速影像方法和体外流式细胞仪的概念,可实时检测活体CTC并可以进行定量分析与检/监测,可用于实验室对肿瘤治疗效果的早期实时监测及评估,药物的早期筛选等。
  IVFC技术原理是:带有荧光标记的癌细胞在流动过程中经过放置于血管某处横截面的一束激光,其受激发射的荧光信号通过光电转换和模/数转换在计算机中储存,通过一段时间内检测荧光信号来实时记录循环系统中流过的癌细胞的数量。这种方法主要的特点是不用抽血,可在血管中检测,属于微创体内诊断方法。


浮游植物流式细胞仪利用流式细胞测量技术,在野外现场快速对水体中的浮游植物进行计数的仪器。与传统的生物医学流式细胞仪相比,具有如下显著特点。
  1)细胞粒径范围大,可测量0.4 um-4000 um间的浮游植物,几乎覆盖自然界的所有浮游植物粒径范围
  2)检测器强大,目前一台标准的浮游植物流式细胞仪CytoBuoy配备6种检测器:前向光散射(FSC)、侧向光散射(SSC)、红色荧光、绿色荧光、橙色荧光和曲度检测器。可以对浮游植物进行分类。
  3)坚固、耐用、轻便,适合野外现场测量,而传统的流式细胞仪非常笨重,只能实验室内使用。
  4)样品不需任何前处理,可以直接测量。传统的流式细胞仪前处理复杂,处理不好就会阻塞管路。
  5)不需外加鞘液,仪器自动采用水样的滤液为鞘液,维护方便。
  6)多版本可选。有便携式机型CytoSense、在线监测型CytoBuoy和水下型CytoSub。
  7)可建立浮游植物专家库,可对自然界水样中的特点浮游植物(如易引发赤潮的硅藻和甲藻)鉴定到种,进行早期预警
  8)新增成像功能,可拍摄特定细胞的显微照片。

流式细胞术Protocal

一、样品的制备

流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号,因此,细胞必须做成单个细胞悬浮状态,不能聚集,也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异(如特异单抗),而且不允许渗透至载液中。
标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系,要经Ficoll分离,作单细胞分离处理,但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞,需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等),化学法(EDTA、EGTA和柠檬酸盐)消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS,柠檬酸盐的浓度为40μmol/L,并同时采用机械分散法,将经消化处理的膨松组织,用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可,用PBS洗2~3次后重悬,最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL
若标本用于测定单个细胞,需加入1~5 mg/L的DNAase,将有助于阻止破碎细胞释放的DNA造成细胞再聚集,但是若分离的细胞要作DNA含量测定之用时,则切勿加DNAase。
二、悬浮细胞的固定

上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析,如果染色和流式分析要拖后进行,或为了提高染色效果,则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。
1、固定方法:
(1)甲醛法:在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank'S液配)4℃下固定12-18小时。
(2)乙醇法:细胞悬于PBS中,缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇,使终浓度为70%,冰浴30分钟。
(3)丙酮法:于细胞悬液中,缓慢加入冷丙酮,使终浓度为85%。
2、实例:
(1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液,将细胞制成1×106细胞的悬液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95%乙醇,连续搅拌使乙醇终浓度达70%。
(3)该细胞可在4℃下保存数日。
(4)分析前先用1000r/min离心10分钟,弃去乙醇,再将细胞悬于PBS中或要求的试剂中。
三、流式细胞仪分析的应用

(一)非染色细胞的光散射
一个粒子(如细胞)出现在一束光线中,立即会干扰该光束,造成该光束入射光的重分布,该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来,这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系,可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。
一般认为,90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响,而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下:
(1)将细胞悬浮于HBSS中,浓度介于1×106~2×106/mL浓度之间。
(2)以悬浮细胞平衡盐溶液(HBSS)充满含鞘液的细胞贮藏池。
(3)设定细胞流量为500个/S(秒),以获得最佳测定结果。
(二)染色法
1  细胞的碘化丙锭(propiolium iodide PI)染色
PI和EB(溴化乙锭)为同类物质,与EB一样,PI嵌入DNA双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,PI的荧光强度约为EB染色的1.8倍,以488nm波长激发,DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。
1.1  小鼠Lewis肺癌细胞(3LL)DNA含量测定方法
(1)从C57BL/6小鼠上切除肿块,在培养皿内用PBS冲洗;
(2)去除结缔组织及脂肪,剪碎肿块;
(3)小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。
(4)将200~300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL),染色3LL细胞,于4℃存放20~30分钟。
(5)测定580~750nm之间的发射荧光,以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。
注:PI染色液:0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。
1.2  培养细胞DNA的流式细胞仪分析
(1)从培养皿中吸去培养基,以HBSS冲洗二次;
(2)加入PI5mL于培养皿中,在4℃放10分钟;
(3)用吸管反复次打细胞,使细胞破坏,胞核释放出来,再行流式细胞仪分析。
1.3  完整细胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的细胞悬液,离心,去固定液;
(2)室温条件下加入PI染色一批细胞(105~106细胞/mL),时间为30分钟,然后行流式细胞仪分析。
1.4  光辉霉素和PI的DNA染色
在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中,光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移,该染色技术主要用于实体肿瘤组织,精子细胞及妇科标本,同时也适用于体外培养的细胞。
(1)分离制备的细胞悬液即可使用,若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光辉霉素染色,4℃1小时(PI为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L)。
(3)染色后进样,以100W汞灯作为激光光源,使用BG123nm阻断滤片,叠加K590型高通滤法(one seep filter)。
2、DNA和RNA的鉴别染色
利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下:
(1)试剂:
溶液A:低温保存,稳定期约2周。
Triton X-100(0.1%) 0.1mL,1mol/L HCL  8mL
1mol/L NacL 15ml蒸馏水76mL,PH1.5(100mL)
溶液B:稳定期数月,最好除菌以后(高压或过滤)贮存。
0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL
0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL
蒸馏水24mL,总体积为99mL pH6.0
吖啶橙母液:
用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物,应小心),吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。
注意:仪器鞘流系统应保持4℃。
氩激光激发波488nm,红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制细胞悬液,取0.2mL(8×106细胞/mL),加入0.4mL溶液A,4℃放置45~60秒。
②加1.2mL含吖啶橙的溶液B,室温2分钟。
③应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。
注意:①细胞数保持恒定;②核酸与吖啶橙的比例;③染色时间及温度。
(三)染色法的应用
1、变性及双链DNA的鉴别染色
(1)试剂:
HBSS内含1000u/mL RNA酶A,0.2mol/L KCl pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4缓冲液,pH2.6。
①2×106细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。
②37℃温育1小时。
③将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀,20℃ 30分钟。
④加2mL吖啶橙染色2分钟。
⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。
2、DNA与癌基因探针双标记测定
这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物,然后用PI标记DNA,现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤:
(1)制备白血病细胞悬液,用100%甲醇在-20℃固定10分钟。
(2)取50μl50 mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体,可特异性地直接与N-ras,Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合),4℃作用30~45分钟。
(3)用PB离心洗涤2次,重悬浮于50μL HBSS中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清)。
(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG,4℃放置30~45分钟。
(5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC标记的羊抗兔IgG,4℃反应30~45分钟。
(6)同(3)洗涤后,细胞用RNA酶消化,室温20~30分钟。
(7)同(3)洗涤后,用PI染液染20分钟。
(8)同(3)洗涤后,用488nm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物,PI染色显示DNA含量。
注意事项:
①制备样品时,离心次数不宜过多,防止细胞丢失和凝集;
②细胞固定时间不宜过长,不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂;
③为了降低本底,应将细胞表面未结合的荧光染料洗净;
④进行双标记沉淀时,应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。
3、以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。
(1)试剂:
用培养基配制33 mg/L Brdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。
染色液:Hoechst33258溶于PBS,细胞染色24小时后进行分析,据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。
(2)方法:
①将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。
②根据细胞周期时间不同,选择不同时间培养的细胞。
③孵育后,摇散细胞以传代培养。
④直接用染液重悬细胞,进入流式细胞仪分析。
Hoechst33258荧光值在410~580nm之间,需用330~360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此,不仅特异性标记DNA,亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时,在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶,因此,处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态,并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰,此项技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。
4、Hoechst33342染色活细胞DNA
(1)试剂:Hoechst 33342,用蒸馏水配成0.25mol/L。
(2)方法:
①制备106/m细胞悬液,以Hoechst33342染色,浓度为5~10 mg/L ,室温下20分钟。
②分析前切勿洗涤细胞。
Hoechst33342可用作细胞DNA的活体染料,据信可在保持细胞活性的同时,呈现出相当好的DNA化学计量关系,激发波在紫外范围350~363nm之间,发射波则在450nm处。
5、以异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC)染色蛋白质。
(1)试剂:异硫氰酸荧光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1~1.0 mg/L浓度。
(2)方法:
①染色前用终浓度70%乙醇固定细胞,至少18小时。
②离心固定细胞,弃去固定液。
③室温下用FIFC染色细胞蛋白,30分钟。
④流式细胞仪分析,使用氩激光,激发波长488nm,荧光发射波长515~535nm。
也可于固定细胞中,以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase,PBS配制)染色20分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色,分别呈现红色荧光(DNA)和绿色荧光(蛋白质)。
6、荧光素抗体的应用
该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞,可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞;也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白,抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸盐缓冲液Eagle's MEM稀释FIFC连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FIFC抗体的最适度的稀释浓度,向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液,再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I抗体分析时,应稀释成5 mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×107浓度时其存活率应在90%以上。
方法:
(1)于微量滴定板加入50μL抗体稀释度,再加入50μL细胞悬液,混匀。
(2)冰浴45分钟,离心滴定板(1500r/min 10分钟)。
(3)弃上清,以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次,每次洗涤后用1500r/min 10分钟,弃上清。
(4)以1ml预冷的培养基配成1×106细胞/mL的已染色细胞悬液,进样前持续保持冷环境(4℃)。


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